Nanoscopie RESOLFT appliquée à l'étude de l'adhésion cellulaire

RESOLFT Nanoscopy to study cellular adhesions

• Auteur / Autrice : Ani Augustine Jose
• Direction : Brahim Lounis, Grégory Giannone
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Lasers, Matière et Nanosciences
• Date : Soutenance le 15/11/2019
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences physiques et de l’ingénieur (Talence, Gironde)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Photonique, Numérique et Nanosciences (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Valentin Nägerl
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Brahim Lounis, Grégory Giannone, Stefan Jakobs, Dominique Bourgeois, Renaud Poincloux, Sophie Perotin, Jean-Baptiste Trebbia
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stefan Jakobs, Dominique Bourgeois

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nanoscopie optique super-résolue 3D

Cellules -- Adhésivité

Mots clés libres

Adhesion cellulaire

Resolft

Nanoscopie

Resolft

Cell adhesion

Nanoscopy

Résumé

Les cellules peuvent ajuster leur adhésion au substrat et leur cytosquelette en fonction des variations de nature biochimique et physique de leur environnement. En retour, les cellules peuvent également contrôler leur microenvironnement en adhérant et en générant des forces sur les cellules voisines et la matrice extracellulaire. Les adhérences focales (AF) dépendantes des intégrines sont ainsi les zones de convergences de ces interactions, intégrant les signaux biochimiques et biomécaniques entre les composants intracellulaires et extracellulaires. Diverses fonctions cellulaires liées aux AF sont associées à la formation et à la cohésion des tissus. Les cellules cancéreuses qui se propagent dans le système circulatoire utilisent des mécanismes associés à l'adhésion cellulaire pour établir de nouvelles tumeurs dans le corps.Les techniques nanoscopiques ont révolutionné l'étude des structures biologiques en permettant à la microscopie optique d’imager sous la limite de diffraction. Le RESOLFT (Reversible Saturable OpticaL Fluorescent Transitions) permet de dépasser cette limite de diffraction en réduisant le volume d'émission par un procédé réversible On-Off. Après avoir étudié la photophysique de la protéine fluorescente rsEGFP2 qui a la propriété d’être réversiblement commutable, pour déterminer son potentiel d'utilisation pour l'imagerie RESOLFT, nous avons utilisé les paramètres photophysiques obtenus dans la construction d’un nanoscope RESOLFT. L’utilisation de cette approche a permis d’acquisition d'image à une résolution 4 fois supérieure à la limite de diffraction (~50 nm). Le RESOLFT présente aussi l’avantage de ne nécessiter qu’une faible intensité laser, ce qui réduit l'effet de photo-blanchiment et permet des acquisitions longues sur cellules vivantes.Nous avons ensuite utilisé le RESOLFT pour étudier l'initiation, la stabilisation et le désassemblage des AF. Nous avons pu étudier la réorganisation dynamique de diverses protéines impliquées dans la formation d’AF sur des fibroblastes embryonnaires murin et des tissus ovariens de drosophila melanogaster. Nous avons observé au sein des AF des amas de β3-integrin-rsEGFP2 dont la taille est inferieurs à la limite de diffraction, prouvant ainsi la capacité du RESOLFT à étudier la réorganisation à l'échelle nanométrique des protéines dans les AF. Nous avons aussi observé une organisation rapide des amas de β3-integrin-rsEGFP2 à l'intérieur des AF, la durée de vie des amas n’étant que de quelques dizaines de secondes. Ces données sous-tendent un modèle de remodelage constant des amas des protéines des AF. Il était également évident que seule une faible densité d’amas d'intégrines est nécessaire pour maintenir les AF. De plus, nous avons observé un flux rétrograde d’amas de talin-rsEGFP2 dans les AF. La vitesse mesurée de ce flux s'est avérée similaire à celle obtenue par suivi de molécules uniques. Nous avons également étudié la dynamique des amas de zyxine dans les AF et observé des fluctuations du taux de zyxine au sein des AF. Nos expériences indiquent un lien entre ces fluctuations et les forces mécaniques existantes dans les AF.Enfin, pour augmenter la vitesse d’acquisition, nous avons parallélisé notre configuration RESOLFT à l'aide d’un maillage optique. Les maillages optiques sont des configurations périodiques de lumière formées par interférence. Comparé à notre première implémentation du RESOLFT, qui permet de sonder qu’un seul point à la fois, les maillages optiques peuvent être utilisés pour sonder simultanément plusieurs points. Nous avons également mis en place un deuxième maillage optique permettant la commutation du fluorophore, ce qui nous a permis de réduire les effets de photo-blanchiment lors de l'imagerie. Cette configuration en double maillage nous a permis d'obtenir une série d’images (>40 images) de nanostructures avec des résolutions proches de 55 nm sur des cellules vivantes à une fréquence de 0,3 kHz sur un champ de vision 15x15μm.

Cells can adjust their adhesive and cytoskeletal organizations depending on the changes in the biochemical and physical nature of their surroundings. In return, cells can also control their microenvironment by adhering and generating forces on neighboring cells and extracellular matrices. Integrin-dependent adhesion sites (AS) are the converging zones of these interactions, integrating biochemical and biomechanical signals between intracellular and extracellular components. Various cellular functions linked to AS are associated with the formation and cohesion of tissues. Cancer cells that spread through the circulatory system use mechanisms associated with cell adhesion to establish new tumors in the body.Nanoscopic techniques have revolutionized the study of biological structures by bringing sub-diffraction imaging into the realm of light microscopy. RESOLFT (Reversible Saturable Optical Fluorescent Transitions) break the diffraction barrier by suppressing the volume of emission through a reversible on-off process. We studied the photophysics of a reversible switchable protein called rsEGFP2 expressed in living cells. The parameters for photoswitching obtained from these studies were used to implement a RESOLFT nanoscope. Using this system, we have demonstrated an imaging resolution close to 50 nm, a 4-fold improvement over the diffraction limit. RESOLFT nanoscopy requires less intensity to obtain a super-resolved image, thereby reducing the effect of photobleaching and enabling long term live cell imaging.We then used the RESOLFT nanoscope to study the initiation, stabilization, and disassembly of AS. Using this technique, we were able to study the dynamic reorganization of various proteins involved in the formation of AS on mouse embryonic fibroblasts and ovarian tissues of drosophila melanogaster. We observed clusters of β3-integrin-rsEGFP2 within the AS that are smaller than the diffraction limit, demonstrating RESOLFT's ability to study the nanoscale organization of proteins in the AS. We also observed a rapid reorganization of the β3-integrin-rsEGFP2 clusters within the AS, with the cluster lifetime only being a few tens of seconds. These data suggest a model of constant remodeling of AS protein clusters. In the case of Talin rsEGFP2, we observed a rearward flow of clusters towards the interior of the cell. The speed of this flow was measured and was found to be close to the speed measured by other techniques like single-molecule tracking. We also studied the dynamics of zyxin nanoclusters in AS. We recorded nanoscale fluctuations of zyxin levels in AS, and our experiments indicate a link between this fluctuation and mechanical forces existing inside AS.To enable faster imaging, we parallelized our RESOLFT setup using optical lattices. Optical lattices are periodic patterns of light formed through interference. Compared to our first implementation of RESOLFT, which probes only a single point at a time, optical lattices can be used to probe multiple points simultaneously. We also implemented a second lattice for fluorophore on switching, which helped us to reduce the effects of photobleaching during imaging. The dual lattice setup allowed us long term imaging (>40 frames) of nanostructures with resolution close to 55 nm inside living cells, at a frame rate of 0.3kHz over a 15x15μm field of view.