Identification et caractérisation de polymorphismes génétiques impliqués dans la réponse à l’imatinib dans la leucémie myéloïde chronique

Identification and characterisation of genetic polymorphisms associated to imatinib sensitivity in chronic myeloid leukemia

• Auteur / Autrice : Florence Lichou
• Direction : Béatrice Turcq
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 17/05/2019
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Actions for OnCogenesis understanding and Target Identification in ONcology (Bordeaux ; 2016-2021)
• Jury : Président / Présidente : Stephen Manon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Béatrice Turcq, Stephen Manon, Anne-Sophie Lia Baldini, Stéphane Prost
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne-Sophie Lia Baldini, Stéphane Prost
• DOI : 10.70675/52ad57a0z07adz4ed1zb3ebzdb80d7a83ff8

Mots clés

Mots clés contrôlés

Leucémie myéloïde chronique

Imatinib

Mots clés libres

Leucémie myéloïde chronique

Résistance au traitement

Polymorphismes génétiques

Apoptose

Séquençage nouvelle génération

Bcl-Rambo

Chronic myeloid leukemia

Treatment resistance

Genetic polymorphisms

Apoptosis

Next-Generation sequencing

Bcl-Rambo

Résumé

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif rare traité par des inhibiteurs de tyrosine kinase, tel que l’imatinib. Malgré son efficacité, la résistance au traitement est un problème récurrent. Des variants génétiques responsables d’une altération de la mort cellulaire programmée (apoptose) pourraient notamment expliquer l’hétérogénéité de la réponse au traitement entre les patients. Dans un premier temps, l’objectif était de rechercher des variants candidats. Pour cela un panel de 45 gènes impliqués dans l’apoptose a été étudié par séquençage nouvelle génération chez 24 patients atteints de LMC, 12 répondeurs et 12 résistants au traitement par imatinib. A l’aide d’outils informatiques, 473 polymorphismes ont été détectés. Le nombre de patients étudiés étant limité, de nouvelles méthodes statistiques ont dû être développées pour analyser les résultats obtenus. Tout d’abord, les fréquences de survenue des variants chez les patients résistants et répondeurs ont été comparées aux fréquences observées dans la population générale et visualisées par une approche de statistiques descriptives. Cette stratégie a permis de réduire la liste à 95 polymorphismes pouvant être impliqués dans la résistance au traitement. Par la suite, les gènes ont été classés selon leur enrichissement en allèles variants. Au final, trois gènes candidats ont été choisis et séquencés chez 103 patients. Cette méthodologie, automatisée grâce à un algorithme informatique, a permis de mettre en évidence, un variant non synonyme dans le gène BCL RAMBO, retrouvé plus fréquemment chez les patients résistants de manière significative. Dans un second temps, l’objectif était de caractériser le rôle de ce variant dans la réponse à l’imatinib à l’aide de lignées cellulaires modifiées par la technologie CRISPR-Cas9. Des cellules n’exprimant plus la protéine ont été obtenues et ont permis de mettre en évidence le rôle majeur de la protéine BCL RAMBO dans l’inhibition de l’apoptose. Des lignées cellulaires portant le variant candidat ont également été créées à l’aide d’une nouvelle technique utilisant CRISPR-Cas9 : l’exon entier contenant le nucléotide d’intérêt a été remplacé par un exon modifié. La modification d’un acide aminé induite par le variant a été associé à une perte de la sensibilité au traitement par imatinib dans ces lignées, comme suggéré après séquençage des patients. Ces données indiquent que BCL-RAMBO, facteur anti-apoptotique dans une lignée modèle de LMC, pourrait devenir une nouvelle cible thérapeutique afin de surmonter la résistance à l’imatinib

Chronic myeloid leukemia (CML) is a rare myeloproliferative syndrome treated by tyrosine kinase inhibitors, such as imatinib. Despite its efficacy, resistance to treatment is a persistent clinical issue. Notably, genetic variants causing alterations in apoptosis may explain heterogeneity of imatinib sensitivity between patients. First, the goal was to look for candidate variants. For that purpose, a panel of 45 apoptotic genes was assessed by next-generation sequencing on 24 CML patients, 12 sensitive and 12 resistant to imatinib treatment. Using informatics tools, 473 polymorphisms were detected. As the number of sequenced samples was limited, novel statistical methods had to be developed to interpret the results. The variant frequency in resistant and sensitive patients was compared to variant frequency in the general population and visualized using descriptive statistics. This strategy allowed to obtain a restricted list of 95 polymorphisms that might be involved in resistance to the treatment. Then, genes were ranked according to variant allele enrichment. At the end, three candidate genes were chosen and sequenced for 103 CML patients. This methodology, automated using a computer algorithm, permitted to highlight a nonsynonymous variant in the BCL RAMBO gene, significantly found more often in resistant patients. Second, the objective was to characterize the role of this variant in response to imatinib using model cell lines modified by CRISPR-Cas9 technology. BCL-RAMBO knock-out cells were obtained and allowed to demonstrate the major role of BCL-RAMBO protein in apoptosis inhibition. Additionally, cell lines carrying the variant were created using a new CRISPR-Cas9 mediated technique: the whole exon carrying the nucleotide of interest was replaced with a variant exon. The amino acid change induced by the identified polymorphism was associated with a loss of sensitivity to imatinib treatment in these cell lines as suggested after patient sequencing. These data indicate that BCL-RAMBO, anti apoptotic factor in a CML cell line, could become a novel therapeutic target to overcome drug inefficacy for a subset of resistant patients.