Évaluation de l'impact de la conservation sur la viabilité et la cultivabilité du microbiote intestinal humain

Evaluating the conservation effect on the viability and culturability of the human gut microbiota

• Auteur / Autrice : Sara Bellali
• Direction : Didier Raoult
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 21/11/2019
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Mephi (Marseille) - Méditerranée Infection
• Jury : Président / Présidente : Florence Fenollar
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Fenollar, Bourèma Kouriba, Max Maurin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bourèma Kouriba, Max Maurin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lyophilisation

Métagénomique

Microbiome gastro-intestinal

Flore intestinale

Mots clés libres

Microbiote intestinal humain

Great plate count anomaly

Viabilité/cultivabilité

Métagénomique

Lyophilisation

Microbial culturomics

Human gut microbiota

Great plate count anomaly

Viability / culturability

Metagenomics

Freeze-Drying

Microbial culturomic

Résumé

Le microbiote intestinal humain abrite un grand nombre de micro-organismes qui jouent un rôle crucial dans la santé humaine. Cependant, le nombre de bactéries détectées par des méthodes quantitatives indépendantes de la culture s'est révélé beaucoup plus élevé que celui des bactéries cultivées sur des géloses. Cet écart est connu sous le nom de la « Great plate count anomaly ». L'objectif principal de ce travail était d'expliquer ''l’incultivabilité" des bactéries intestinales et de maintenir leur viabilité. Dans ce travail, nous avons constaté que l'exposition à l'oxygène pendant plus d'une heure réduisait la cultivabilité des bactéries à 50%. De plus, lorsque les échantillons ont été exposés à l'oxygène pendant moins de 2 minutes, la cultivabilité a augmenté à 87%. Ce dernier résultat suggère que la non-cultivabilité pourrait être due au fait que les bactéries sensibles à l'oxygène étaient à l'état viable mais non cultivable, ou qu'elles étaient blessées ou mortes. Ce résultat a été confirmé lorsque nous avons séquencé les bactéries vivantes, blessées et mortes triées par le FACS. 28 % des UTOs correspondaient à des bactéries mortes, dont environ deux tiers étaient inconnues, et la majorité de ces bactéries étaient sensibles à l’oxygène. D'autre part, notre nouveau milieu protecteur a démontré son efficacité sur les échantillons fécaux et les bactéries sensibles à l'oxygène. En conclusion, notre étude nous a permis d’explorer la « dark matter » du microbiote intestinal humain et a révélé que la métagénomique et l'approche culturomics sont nécessaires pour bien comprendre la diversité et la richesse des bactéries cultivables et non cultivables.

The human gut microbiota harbors a wide range of microorganisms that play a crucial role in human health. However, the number of bacterial cells detected by quantitative culture-independent methods was found to be much higher compared to that of cultured bacteria on agar plates. That discrepancy is known as the “ Great plate count anomaly ”. The main goal of this work was to investigate the “ unculturability ” of gut bacteria and maintain their viability. we found that exposure to oxygen for more than 1 hour decreased the culturability of bacteria to 50%. More importantly, when samples were exposed to oxygen for less than 2 min, the culturability increased to 87%. This result suggested that the non-culturability might be due to the fact that oxygen-sensitive cells were in the viable but non-culturable state, or either injured or dead. This funding was confirmed when we sequenced the FACS sorted live, injured and dead bacteria, where, 28% of of bacterial OTUs in total fecal samples were exclusively found dead and/or injured. Among these non-live bacteria, about two-thirds were unknown, thus a large amount were anaerobic. In the other hand, our new protectant medium showed its effectiveness on fecal samples and oxygen sensitive bacteria. In conclusion, our work has confirmed the importance of sample conditioning and processing to obtain the best culture conditions and isolation rates. In addition, our study allowed us to shed light on the dark matter of the human gut microbiota and revealed that both metagenomics and culturomics approach are needed for full insight into the diversity and richness of culturable and unculturable bacteria in the human gut microbiota.