Analyses pharmacologiques et génétiques de la régulation épigénétique dans le pathogène humain Leishmania

par Suzanne Lamotte

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Infectiologie

Sous la direction de Eric Prina et de Gerald Späth.

Soutenue le 21-09-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Institut Pasteur. Unité de parasitologie moléculaire et signalisation (Paris) (laboratoire) et de Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019) (établissement de préparation) .

Le président du jury était Isabelle Dimier-Poisson.

Le jury était composé de Eric Prina, Gerald Späth, Isabelle Dimier-Poisson, Priscille Brodin, Sandrine Cojean, Nicolas Fasel, Marc Ouellette.

Les rapporteurs étaient Priscille Brodin, Sandrine Cojean.

mots clés

• Anti-leishmaniens
• Leishmania
• Évaluation préclinique de médicament
• Épigenèse génétique
• Méthylation
• Histone acetyltransferases

Résumé

L’incidence des leishmanioses est en progression constante et les principales raisons en sont le manque de mesures préventives, un arsenal thérapeutique spécifique restreint, ou encore l’apparition de parasites résistants aux principes actifs des anti-leishmaniens courants. Mes travaux de thèse ont consisté, d’une part à développer de nouvelles techniques de criblages de molécules à visée anti-Leishmania et de les appliquer sur plusieurs banques de composés et, d’autre part, de déterminer si des mécanismes épigénétiques pouvaient être impliqués dans la régulation de l’expression des gènes chez les leishmanies et dans la subversion de la cellule hôte et la survie intramacrophagique de Leishmania. L’approche pharmacologique a été basée sur l’utilisation de tests mesurant l’activité anti leishmanie à la fois sur la forme cliniquement pertinente c’est-à-dire l’amastigote intramacrophagique et sur la forme libre présente chez le phlébotome, le promastigote. La combinaison des tests effectués sur les différents stades de développement et sur deux espèces de leishmanie, l’une dermotrope et l’autre viscérotrope, a permis de proposer une nouvelle procédure permettant de mieux appréhender l’activité anti-leishmanienne et la toxicité vis-à-vis des cellules hôtes des composés testés. Sur 722 composés testés, 225 ont montré une activité anti-parasitaire intéressante selon l’espèce, le stade et la concentration, dont certains étaient classés comme inhibiteurs épigénétiques. Cette approche pharmacologique a permis de mettre en évidence un rôle potentiel de l’épigénétique dans deux aspects de la biologie de Leishmania, que j’ai étudié par la suite. Tout d’abord, par une approche phylogénétique, j’ai révélé l’importance potentielle de l’épigénétique dans la biologie de Leishmania. J’ai analysé les génomes de 4 espèces de Leishmania et trouvé des gènes présumés codant pour des enzymes modifiant les histones, régulant la méthylationet l’acétylation. Je me suis ensuite intéressée aux modifications post-transcriptionnelles potentielles de l’histone H3. Un alignement de séquences multiples des histones H3 de différents mammifères et de Leishmania montre 60% d’homologie, avec d’importantes différences dans la queue N-terminale, suggérant une compaction de l’ADN et une régulation de l’expression des gènes spécifiques au parasite. En revanche, certaines modifications d’acides aminés de H3 sont conservées et ont été révélées dans des analyses d’immunofluorescence chez le promastigote en utilisant des anticorps commerciaux ciblant la méthylation de H3K4, H3K23, H3K27 et H3K36. Les modifications épigénétiques spécifiques ou conservées du parasite pourraient être des cibles thérapeutiques intéressantes chez Leishmania, et j’ai d’ailleurs étudié le mode d’action de deux catégories d’inhibiteurs épigénétiques. Par ailleurs, par le criblage de librairies d’inhibiteurs épigénétiques, j’ai découvert des composés ayant uniquement une activité sur les amastigotes intracellulaires, suggérant une implication des mécanismes épigénétiques dans la survie intracellulaire du parasite. J’ai révélé par des analyses d’immunofluorescence et de western blot différents niveaux de méthylation des histones entre les macrophages non infectés et infectés, montrant une possible modulation de la régulation épigénétique de la cellule hôte par Leishmania afin de promouvoir sa survie intracellulaire. Pour évaluer cette hypothèse, j’ai conduit une analyse de séquençage de l’ARN pour étudier le mode d’action des inhibiteurs des déméthylases des histones, qui pourraient agir sur les mécanismes de régulation épigénétique du macrophage afin de restaurer ses propriétés leishmanicides. Ce travail pourrait permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’interaction hôte pathogène, dont certaines pourraient avoir un mode d’action via l’hôte, ce qui aurait l’avantage d’éviter la génération de parasites résistants.

Titre traduit

Pharmacological and genetic analyses of epigenetic regulation in the human pathogen Leishmania

Résumé

The incidence of leishmaniases is steadily increasing, mainly due to the lack of preventive measures, a limited therapeutic arsenal, and appearance of resistant parasites to all current treatments. My thesis research consisted, on one hand, to develop new techniques for selecting efficient anti-leishmanial molecules and screening various compounds libraries, and on the other hand, to determine if epigenetic mechanisms are involved in the regulation of Leishmania gene expression and Leishmania host cell subversion and intracellular survival. The pharmacological approach was based on assays measuring anti-leishmanial activity on the clinically relevant stage, the intramacrophagic amastigote, and on the extracellular stage present in the phlebotome, the promastigote. Combination of assays applied on different stages and different species, one dermotropic and one viscerotropic, allowed the identification of pan-active compounds without toxicity against the host cell. Among 722 tested compounds, 225 showed interesting anti-parasitic activity depending on Leishmania species and stages at different concentrations between 4 and 10 µM, some of which were classified as epigenetic inhibitors. This pharmacological approach highlighted a possible role of epigenetics in two aspects of Leishmania biology that I have investigated in the following. First, applying a phylogenetic approach, I revealed a potential role of epigenetics in Leishmania biology. I analyzed genomes of 4 Leishmania species and found genes encoding for putative histone modifying enzymes, regulating the level of methylation (5 demethylases and 48-49 methyltransferases, depending on species) and acetylation (7 deacetylases and 15-17 acetyltransferases, depending on species). I next focused on potential post-transcriptional modifications of histone H3. The multiple sequence alignment of H3 from different mammals and Leishmania showed 60% homology, with important differences in the N-terminal tail, suggesting parasite specific DNA compaction and gene expression regulation in Leishmania. In contrast, some amino acid modifications of H3 were conserved and revealed in immunofluorescence analyses in promastigotes using commercially available antibodies against methylation of H3K4, H3K23, H3K27 and H3K36. Parasite-specific and conserved epigenetic modifications could be interesting drug targets in Leishmania, a possibility I investigated by studying the mode of action of two selected categories of epigenetic inhibitors (i.e. DNA and histone methylation inhibitors). Second, screening epigenetic inhibitor libraries, I discovered compounds that show activity only against intracellular amastigotes, suggesting an implication of epigenetic mechanisms in the intramacrophagic survival of Leishmania. I revealed by immunofluorescence and western blot analyses different histone methylation levels between non-infected and infected macrophages, suggesting that intracellular Leishmania can modulate host cell epigenetic regulation to promote its intramacrophagic survival. To assess this hypothesis, I conducted RNAseq analyses to address the mode of action of histone demethylases inhibitors, which could act on macrophage epigenetic regulation mechanisms restoring its leishmanicidal properties. This work should allow the discovery of new therapeutic targets in host-Leishmania interaction, some of which may have a host-directed mode of action, which may incite the development of new treatment options that are more refractory to the emergence of drug-resistant parasites.