Rôle des phages dans l'évolution des leptospires

par Olivier Schiettekatte

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé. Microbiologie

Sous la direction de Pascale Bourhy.

Soutenue le 12-11-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Unité Biologie des Spirochètes (Paris) (laboratoire) et de Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019) (établissement de préparation) .


  • Résumé

    La leptospirose est une zoonose bactérienne de répartition mondiale causée par des leptospires pathogènes dont le réservoir principal est le rat, qui disperse la bactérie dans l’environnement via ses urines. Malgré l’importance déterminante de la survie des leptospires dans l’environnement, en particulier dans les eaux douces, l’écologie de ces spirochètes reste méconnue. Le genre Leptospira est très diversifié, avec 34 espèces et plus de 300 sérovars. Les leptospires sont classés selon leur phylogénie en trois groupes : les espèces pathogènes, intermédiaires et saprophytes. Les études phylogénétiques et évolutives sont rares et ne prennent pas en compte les leptospires saprophytes qui sont peu recherchés, ce qui constitue un biais important pour des études évolutives robustes. Les virus exercent une pression évolutive majeure chez beaucoup de modèles bactériens ; pourtant, les rôles des phages et prophages dans l’évolution des leptospires n’ont pas encore été investigués et l’isolement de nouveaux leptophages n’a plus été rapporté depuis 30 ans. Le séquençage du seul phage tempéré de leptospires a permis l’identification de prophages au sein du genre. Ceux-ci ont été trouvés dans le génome de leptospires pathogènes uniquement, suggérant un lien avec la pathogénie.Dans ce travail de thèse, un premier axe de recherche a été développé sur l’étude des phages de leptospires. Nous avons caractérisé de façon morphologique, génomique, et protéomique les deux seuls leptophages lytiques connus, LE3 et LE4, dont l’hôte est une espèce saprophyte. Les études génomiques de LE3 et LE4 ont montré très peu de similarités avec les génomes de virus connus ; mais ont néanmoins permis d’identifier un nouveau prophage au sein du génome de l’espèce pathogène L. mayottensis. Des tests d’induction à la mitomycine C ont été effectués sur plusieurs souches de leptospires potentiellement lysogènes, et la production de queues de phages a été constatée chez L. interrogans, la principale espèce pathogène. Parallèlement, des phages environnementaux ont été recherchés dans des échantillons d’eaux douces, notamment dans l’écosystème insulaire modèle de Mayotte où la leptospirose est endémique. Dans un second axe de recherche, nous avons entrepris une étude phylogénétique des leptospires pour faire un nouvel état de la diversité du genre, passant, selon nos résultats, de 34 à 64 espèces. Parmi ces espèces, 5 forment un nouveau clade. Le séquençage des génomes entiers de ces souches nous a permis de mettre en place un premier schéma de typage universel pour le genre Leptospira. Nous avons choisi à cette fin le typage moléculaire multi-locus basé sur le core-génome (cgMLST), qui s’appuie sur le séquençage de génomes entiers pour typer les isolats correspondants de façon robuste et profonde. Ce schéma permet aujourd’hui d’étudier l’évolution des leptospires, et de faire un suivi épidémiologique à l’échelle globale. Par ailleurs, l’utilisation du séquençage de troisième génération nous a permis de détecter de nouveaux réplicons extra-chromosomiques dans plusieurs souches de leptospires. Une partie de ces réplicons sont des prophages dont le rôle dans l’évolution des leptospires reste à investiguer.L’exploration de la diversité des leptospires et la caractérisation de nouveaux phages et prophages révèlent une relation étroite entre les leptospires et leurs phages qui était jusque-là inconnue. Ces travaux changent notre vision de l’évolution des leptospires dont la diversité pourrait s’expliquer en partie par la transmission de prophages et la transduction virale.

  • Titre traduit

    Role of phages in the evolution of leptospira


  • Résumé

    Leptospirosis is a bacterial zoonosis of worldwide distribution caused by pathogenic leptospires, whose main reservoir is the rat, which disperses the bacterium into the environment via its urine. Despite the crucial importance of the survival of leptospires in the environment, especially in freshwater, the ecology of these spirochetes remains unknown. The genus Leptospira is very diverse, with 34 species and more than 300 serovars. Leptospires are classified according to their phylogeny into three groups: pathogenic, intermediate and saprophytic species. Phylogenetic and evolutionary studies are scarce and do not take into account the saprophytic leptospires that are little sought-after, this constitutes an important bias for robust evolutionary studies. Viruses exert a major evolutionary pressure in many bacterial models; however, the roles of phages and prophages in the evolution of leptospires have not yet been investigated and the isolation of new leptophages has not been reported for 30 years. Sequencing of the only temperate phage of leptospires made possible the identification of Leptospira prophages. These prophages were found solely in the genome of pathogenic species, suggesting a link with pathogenesis.Herein, we initiate a novel line of research regarding Leptospira phages. The only known lytic leptophages, LE3 and LE4, whose host is a saprophytic species, are characterized morphologically, genomically, and proteomically. Genome studies of LE3 and LE4 showed very little similarity to presently-annotated viral genomes; but have nevertheless made possible the identification of a new prophage within the genome of the pathogenic species L. mayottensis. Mitomycin C induction tests were performed on several putative Leptospira lysogenic strains, and production of phage tails were observed in L. interrogans, the main pathogen. At the same time, environmental phages have been investigated in freshwater samples, particularly in the model ecosystem of Mayotte Island where leptospirosis is endemic.In a second line of research, we undertook a phylogenetic study of Leptospira to make a new inventory of the diversity of the genus, passing, according to our results, from 34 to 64 species. Among these species, 5 form a new clade. The sequencing of whole genomes of these strains allowed us to set up a first universal typing scheme for the genus Leptospira. We have chosen for this purpose the core-genome-based multi-locus molecular typing (cgMLST), which relies on the sequencing of whole genomes to type the corresponding isolates in a robust and deep manner. This scheme now makes possible the study of the evolution of leptospires, and an epidemiological follow-up on a global scale. In addition, the use of third-generation sequencing has allowed us to detect new extra-chromosomal replicons in several leptospiral strains. Some of these replicons are prophages whose role in the evolution of leptospires awaits investigation.The exploration of leptospiral diversity and characterization of new phages and prophages reveal a close relationship between leptospires and their phages that was previously unknown. This work changes our view of the evolution of Leptospira, the diversity of which could be explained partly by transmission of prophages and viral transduction.

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