Potentiel thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses dans l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive

par Clarisse Ganier

Thèse de doctorat en Génétique humaine

Sous la direction de Alain Hovnanian.

Soutenue le 26-11-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) et de Imagine - Institut des maladies génétiques / IMAGINE - U1163 (laboratoire) .

Le président du jury était Martine Bagot.

Le jury était composé de Alain Hovnanian, Martine Bagot, Onnik Agbulut, Francis Palisson, David T. Woodley, Sonia Bouchiha-Gaucher, Matthias Titeux.

Les rapporteurs étaient Onnik Agbulut, Francis Palisson.


  • Résumé

    L'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie génétique cutanée due à des mutations de perte de fonction du gène COL7A1 codant pour le collagène VII. Le collagène VII forme les fibres d'ancrage, structures essentielles pour l'adhésion de l'épiderme au derme sous-jacent. Les patients EBDR développent dès la naissance, des décollements bulleux de la peau et des muqueuses responsables de plaies chroniques et de graves complications locales et systémiques. La survenue de carcinomes épidermoïdes cutanés agressifs reste la première cause de décès. Il n'existe pas de traitement à ce jour. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules multipotentes, isolées à partir de tissus adultes (moelle osseuse, tissu adipeux) ou de tissus périnataux (cordon ombilical). Des travaux antérieurs ont montré que les injections locales et systémiques de CSM issues de la moelle osseuse (CSM-MO) allogéniques ont un potentiel pour réduire l'inflammation cutanée et améliorer la cicatrisation des plaies chez les patients EBDR. Ces améliorations cliniques sont cependant transitoires et les mécanismes d'action des CSM-MO dans l'EBDR ainsi que leur durée de vie après injection sont mal connus. Les CSM-MO pourraient agir via leurs propriétés immunomodulatrices, anti-fibrotiques, pro-angiogéniques, par un effet paracrine permettant l'expression de collagène VII endogène et/ou la sécrétion de collagène VII par les CSM-MO injectées. L'objectif de cette thèse a été d'étudier le potentiel thérapeutique des CSM dans des modèles précliniques de l'EBDR. Nous avons tout d'abord montré que les CSM-MO expriment une quantité d'ARNm de COL7A1 et de collagène VII comparable aux fibroblastes dermiques sains en culture. Nous avons ensuite évalué la capacité des CSM-MO humaines à survivre et produire du collagène VII à la jonction dermo-épidermique (JDE) à long terme après une injection locale dans des peaux équivalentes humaines EBDR greffées sur souris nude. L'injection intradermique (ID) de CSM-MO in vivo a permis de restaurer l'expression du collagène VII ainsi que la formation de fibres d'ancrage à la JDE jusqu'à 6 mois après l'injection. Les CSM-MO sont retrouvées dans la peau équivalente jusqu'à 4 mois après l'injection. Ces résultats montrent qu'une injection ID unique de CSM-MO in vivo permet de rétablir une production prolongée de collagène VII synthétisé par les cellules injectées et d'améliorer l'adhésion dermo-épidermique de la peau équivalente EBDR. Nous avons ensuite comparé l'efficacité des CSM issues de la gelée de Wharton de cordon ombilicaux (CSM-CO) humains aux CSM-MO suivant la même méthodologie que précédemment. Les CSM-CO expriment en culture une quantité d'ARNm de COL7A1 et de collagène VII supérieures aux CSM-MO et fibroblastes dermiques sains. Une injection unique ID de CSM-CO dans la peau EBDR équivalente greffée permet de rétablir une faible expression de collagène VII jusqu'à 4 mois après l'injection. Les CSM-CO sont détectées dans la peau équivalente jusqu'à 2 mois après l'injection. Ces données montrent que les CSM-CO ont une capacité moindre à restaurer l'expression du collagène VII à la JDE comparativement aux CSM-MO injectées dans le même modèle de xénogreffes EBDR. Ces résultats ouvrent la perspective d'une thérapie génique ex vivo utilisant des CSM-MO murines Col7a1-/-. Les souris Col7a1-/- reproduisent les lésions cutanées et muqueuses observées chez les patients EBDR. L'espérance de vie de ces animaux est très réduite. Les CSM-MO murines Col7a1-/- transduites en culture à l'aide d'un vecteur rétroviral SIN exprimant COL7A1 produisent en moyenne 30 fois plus de collagène VII que les CSM-MO murines WT. Des expériences in vivo sont nécessaires pour déterminer si l'injection de CSM-MO génétiquement corrigées ont le potentiel de traiter des lésions cutanées et muqueuses, pour définir la dose optimale et la durée de l'effet chez l'animal. Ceci constituerait une étape importante vers la clinique.

  • Titre traduit

    Therapeutic potential of mesenchymal stromal cells in recessive dystrophic epidermolysis bullosa


  • Résumé

    Recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) is a severe skin disease caused by loss-of-function mutations in COL7A1 encoding type VII collagen. Type VII collagen forms anchoring fibrils which are essential structures for dermal-epidermal adherence. Patients with RDEB suffer since birth from skin and mucosal blistering and develop severe complications. The development of aggressive squamous cell carcinomas is the first cause of demise of these young patients. To date, there is no treatment. Mesenchymal stromal cells (MSC) are multipotent cells, isolated from adult tissue (bone marrow, adipose tissue) or perinatal tissue (umbilical cord). Previous works have shown that local and systemic injections of allogeneic bone marrow-derived MSC (BM-MSC) have a potential to reduce skin inflammation and to improve wound healing in RDEB patients. However, clinical improvement was transient and the mechanisms of action of BM-MSC in RDEB and also their survival after injection are still poorly understood. BM-MSC could act through immunomodulation, anti-fibrotic and angiogenic proprieties, paracrine effects leading to type VII collagen production in the host tissues and/or type VII collagen secretion by injected BM-MSC. The aim of our work was to study the therapeutic potential of MSC for RDEB in preclinical models. We first showed that BM-MSC produce COL7A1 mRNA and type VII collagen levels comparable to healthy dermal fibroblasts in culture. We then assessed the long-term capacity of human BM-MSC to survive, produce and deposit type VII collagen at the dermal-epidermal junction (DEJ) after local injection in human RDEB skin equivalents transplanted onto nude mice. In vivo intradermal (ID) injection of a single dose of human BM-MSC led to the production and deposition of human type VII collagen at the DEJ and allowed anchoring fibrils formation for at least six months post-injection. Injected human BM-MSC were found in the skin at least four months post-injection. These data show that intradermally injected human BM-MSC have the potential to improve dermal-epidermal adhesion of RDEB skin equivalents through sustained deposit of type VII collagen molecules and subsequent anchoring fibrils formation. We then compared the efficacy of human Umbilical Cord Wharton's Jelly-MSC (UC-MSC) with BM-MSC using the same methodology as previously described. UC-MSC showed in vitro a significantly higher amount of COL7A1 mRNA and type VII collagen compared to BM-MSC and healthy dermal fibroblasts in culture. ID injection of a single dose of UC-MSC in vivo led to the production and deposition of low levels of human type VII collagen at the DEJ for four months post-injection. Injected human UC-MSC were found in the skin two months post-injection. These data disclosed a lower efficacy of UC-MSC to restore collagen VII at the DEJ compared to BM-MSC injected in the same xenograft RDEB model. These data open the perspective of using gene-corrected BM-MSC from a Col7a1-/- RDEB murine model to restore normal dermal-epidermal adhesion. Col7a1-/- mice reproduce cutaneous and mucosal lesions observed in RDEB patients. The life expectancy of these animals is very short. We could show that transduction of Col7a1-/- murine BM-MSC in culture using a COL7A1-expressing SIN retroviral vector led to type VII collagen expression levels which were 30-fold higher on average than in BM-MSC from WT mice. In vivo data are required to determine whether the injection of gene-corrected BM-MSC has the potential to treat skin and mucosal lesions in RDEB mice and to define the optimal dose and duration of the effect in vivo. Restoration of type VII collagen expression and anchoring fibrils formation in Col7a1-/- mice would represent an important step towards clinical translation.

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