Identification et caractérisation des déterminants impliqués dans la morphologie de Helicobacter pylori

Identification and characterisation of cell shape determinants in Helicobacter pylori

• Auteur / Autrice : Sofia Pires de Oliveira Pombo
• Direction : Nienke Buddelmeijer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 16/11/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Claudine Mayer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nienke Buddelmeijer, Claudine Mayer, Waldemar Vollmer, Rut Carballido-López, Emmanuelle Bouveret, Sarah Dubrac
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Waldemar Vollmer, Rut Carballido-López

Mots clés

Mots clés contrôlés

Morphologie cellulaire

Helicobacter pylori

Mots clés libres

Helicobacter pylori

Morphologie bactériénne

AmiA

Pbp1

Helicobacter pylori

Cell shape

AmiA

Pbp1

Résumé

Les bactéries ont des formes différentes, ronde, en spirale ou courbé, et conservent leur forme pendant la croissance et la division. La forme bactérienne est le résultat d'une adaptation évolutive en fonction des besoins de survie de chaque espèce, tels que le transport des nutriments, la respiration, la motilité et les facteurs environnementaux. Cependant, le maintien de la forme de la bactérie est également d'adaptation momentanée, c'est-à-dire en fonction de l'environnement, une modification de la forme ou une transition peut se produire pour répondre à des besoins spécifiques. La paroi bactérienne, ou peptidoglycane (PG), est responsable de maintien de la forme bactérienne et protège la cellule contre l'éclatement dû à la pression osmotique. La coordination de la croissance de la paroi au cours de l'élongation et de la division cellulaire entraîne la forme bactérienne. Comment ces deux processus sont-ils régulés et comment l'intégrité de la cellule est-elle maintenue ? Au cours des dernières années, des études réalisées sur des organismes modèles en forme de bâtonnet comme E. coli et B. subtilis ont permis d'obtenir plus de détails sur la régulation de la paroi bactérienne. Le PG est composé de chaînes de sucres réticulées par des liaisons peptidiques. Les enzymes et les protéines régulatrices qui participent à la biosynthèse et au remodelage du peptidoglycane fonctionnent principalement dans les complexes. Helicobacter pylori est une bactérie à Gram négatif qui colonise l'estomac et est la principale cause des ulcères peptiques et du cancer gastrique. Sa forme spiralée et ses flagelles polaires lui confèrent une torsion lui permettent de pénétrer dans la couche de mucus et d'atteindre des cellules épithéliales où elle colonise. H. pylori peut adopter différentes formes; des bâtonnets en spirale ou droites et des coccoids. Chez H. pylori, plusieurs protéines régulatrices de la biogenèse de PG ont été identifiées, dont AmiA, qui est prédite d'avoir une activité N-acétylmuramyl-L-alanine amidase clivant le peptidoglycane entre le squelette de sucre et les premiers acides aminés du fragment peptidique. Les mutants dans lesquels amiA est délété forment de longues chaînes de cellules filles non séparées. Nous avons abordé le rôle de AmiA chez H. pylori par quatre approches complémentaires. 1. caractérisation de la séquence protéique par une approche bioinformatique et de la structure 3D par modelisation ; 2. une approche génétique en créant des mutants dans H. pylori et en effectuant des expériences de complémentation chez un mutant amidase de E. coli ; 3. détermination de l'activité enzymatique de AmiA in vitro ; et 4. localisation de AmiA comme protéine de fusion fluorescente avec GFP chez E. coli. Sur la base de nos résultats, AmiA fonctionne différemment des autres amidases connues, car il est incapable de compléter un mutant de E. coli et ne se localise pas au site de division comme AmiC de E. coli. De plus, les mutants dirigés ciblant le site de liaison potentiel de Zn2+ n'affectent pas la morphologie de H. pylori. Nous émettons l'hypothèse que d'autres protéines impliquées dans la détermination de la forme bactérienne existent. Nous avons développé une criblage par microscopie à haut débit pour identifier de nouveaux déterminants de la forme, avec laquelle la transformation de H. pylori, la croissance et les analyses morphologiques sont réalisées sous forme de plaque à 96 puits. Une bibliothèque ordonnée de mutants de H. pylori peut être criblée dans ce système. En parallèle, nous avons étudié des interactions potentielles entre partenaires ou des protéines régulatrices de la PBP1, basées sur des analyses antérieures transcriptomiques et du protéomiques. PBP1 est la seule enzyme bifonctionnelle chez H. pylori et donc un acteur central dans la biogenèse de la PG. Plusieurs petites protéines, dont la fonction est inconnue, ont été identifiés comme potentiellement essentiels à la viabilité de H. pylori.

Bacteria have different cell shapes from round to rod, spiral or curved and they maintain their shape while growing and dividing. Bacterial cell shape is the result of evolutionary adaptation accordingly to each bacteria survival needs, such as nutrient transport, respiration, motility, and environmental factors. However, cell shape maintenance is not only a question of evolutionary adaptation but also of momentary adaptation, i.e. depending on the environment cell shape modification or transition can occur to answer specific needs. The bacterial cell wall, or peptidoglycan (PG), is responsible for cell shape maintenance and protects the cell from bursting due to osmotic pressure. The coordination of cell wall growth during cell elongation and cell division drive bacterial cell shape. But how are these two processes regulated and how is cell integrity maintained while they are occurring? In the past years, studies performed in rod-shaped model organisms like Escherichia coli and Bacillus subtilis have helped to obtain more insight into bacterial cell wall regulation. The PG is composed of sugar chains that are cross-linked by peptide bonds. The enzymes and regulatory proteins that participate in peptidoglycan biosynthesis and remodeling are mainly working in complexes. Detailed knowledge about this network and how this remodeling mechanism works is still an unanswered question. Helicobacter pylori is a Gram-negative bacterium that colonizes the stomach and is the major cause of peptic ulcers and gastric cancer. Its spiral shape and polar flagella give torsion and enable it to penetrate the mucus layer and reach the epithelial cell layer where it colonizes. H. pylori can adopt different shapes; from spiral rods to straight rods, and coccoids. In H. pylori several proteins that regulate PG biogenesis have been identified, including AmiA, which is predicted to have N-acetylmuramyl-L-alanine amidase activity cleaving the peptidoglycan between the sugar backbone and the first amino acids of the peptide stem. Mutants in which amiA is deleted form long chains of unseparated daughter cells. Here, we addressed the role of AmiA in H. pylori in four different ways. 1. Bioinformatic characterization of the protein sequence and predicted 3D structure; 2. A genetic approach by creating mutants in H. pylori and by performing complementation experiments in an amidase mutant of E. coli; 3. Determination of the enzymatic activity of this protein in vitro; Localization of AmiA as a fluorescent fusion protein with GFP in E. coli. Based on our results, AmiA works differently from other known amidases since it is unable to complement a mutant of E. coli and it does not localize to mid-cell like AmiC of E. coli. Furthermore, site-directed mutants targeting the potential Zn2+ binding site do not affect morphology of H. pylori and cells are similar to wild type. We hypothesize that other proteins involved in cell shape determination and PG regulation do exist. We developed a high-throughput microscopy screen to identify novel cell shape determinants, where transformation of H. pylori, cell growth and morphological analyses are performed in 96-well plate format. An ordered library of H. pylori mutants based on Tn3 transposon insertions can be screened in this set-up. In parallel, we studied potential interactions partners or regulatory proteins of PBP1, based on previous transcriptome and proteome analyses. PBP1 is the only bifunctional enzyme with transglycosylase and transpeptidase activity in H. pylori and therefore a central player in PG biogenesis. Several small peptides, with unknown function, were identified as potentially essential for viability of H. pylori.