Caractérisation moléculaire et étude des conséquences fonctionnelles des mutations somatiques du gène NF1 dans les carcinomes bronchiques non à petites cellules

par Camille Tlemsani

Thèse de doctorat en Génétique cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Eric Pasmant et de Michel Vidaud.

Soutenue le 04-10-2018

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) .

Le président du jury était François Goldwasser.

Le jury était composé de Eric Pasmant, Michel Vidaud, François Goldwasser, Roger Lacave, Jacques Cadranel, Christophe Tournigand.

Les rapporteurs étaient Roger Lacave, Jacques Cadranel.


  • Résumé

    La neurofibromine, produit du gène NF1, agit comme un inhibiteur de la voie RAS-MAPK (Mitogen-activated protein kinases), voie majeure de la cancérogenèse. Le gène NF1 est donc un gène suppresseur de tumeurs. Des mutations constitutionnelles hétérozygotes perte-de-fonction de NF1 causent la neurofibromatose de type 1 (NF1 ; MIM#162200). Cette maladie rare prédispose notamment au développement de tumeurs des gaines nerveuses. Des mutations somatiques de NF1 ont par ailleurs été décrites dans des cancers sporadiques, hors contexte de neurofibromatose. Des données récentes de la littérature confirment que NF1 est un gène suppresseur de tumeurs crucial en oncologie. L'implication de la voie RAS-MAPK dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) est bien caractérisée avec la mise en évidence de mutations somatiques activatrices spécifiques de la voie, notamment des oncogènes EGFR, KRAS et BRAF dans les adénocarcinomes pulmonaires. Cependant, l'implication du gène NF1 a été peu étudiée dans les CBNPC. Nous avons confirmé l'implication de NF1 dans le développement des adénocarcinomes bronchiques par une approche ciblée de NGS (Next Generation Sequencing) sur une cohorte de 138 échantillons tumoraux : 36 altérations somatiques (26%) de NF1 ont été retrouvées dont 25 mutations ponctuelles (parmi lesquelles 4 homozygotes) et 11 délétions. Ces altérations étaient majoritairement exclusives de mutations affectant d'autres effecteurs de la voie RAS-MAPK. Il était retrouvé un nombre plus important d'altérations de NF1 dans les échantillons de patients ayant reçu une chimiothérapie. Une corrélation génotype-phénotype a pu être établie : il s'agissait en majorité d'hommes (72%), fumeurs (75%) avec une survie sans progression et une survie globale significativement meilleures que les patients KRAS mutés. Afin de déterminer les conséquences fonctionnelles des altérations de NF1, nous avons établi des modèles cellulaires mutés dans NF1 grâce au système d'édition du génome CRISPR/Cas9. Trois lignées de carcinomes bronchiques non à petites cellules ont été modifiées génétiquement. Nous avons notamment évalué les conséquences de l'inactivation bi- ou mono-allélique de NF1 réalisée respectivement par CRISPR/Cas9 et Nickase. Les western blot ont confirmé la perte d'expression partielle ou complète de la neurofibromine en cas de mutations mono- ou bi-alléliques du gène NF1 ainsi qu'une activation de la voie RAS-MAPK avec un ratio pERK/ERK augmenté en cas de mutations. Nous avons observé que les clones NF1-/- présentaient un phénotype plus agressif en termes de migration, invasion et prolifération que les clones NF1+/- ou sauvages. L'analyse différentielle des transcriptomes a montré des profils transcriptomiques distincts en cas d'altérations homozygotes ou hétérozygotes de NF1 ainsi que dans les cellules sauvages ; les profils transcriptomiques des clones sauvages étaient plus proches des clones avec mutations hétérozygotes de NF1. Des approches pharmacologiques in vitro sur nos modèles cellulaires transgéniques pour tester la sensibilité aux inhibiteurs de MEK seuls ou en association avec des inhibiteurs de PIK3CA, ainsi que la validation in vivo sur des modèles de xénogreffes murines sont en cours. Notre étude montre que les CBNPC présentant des altérations somatiques de NF1 constituent une entité clinique et pronostique distincte. L'étude de nos modèles cellulaires permettra (1) d'évaluer l'influence du caractère mono- ou bi-allélique des altérations de NF1 sur les conséquences fonctionnelles et (2) de tester de nouvelles perspectives thérapeutiques qu'il conviendra de confirmer in vivo sur des modèles pré-cliniques.

  • Titre traduit

    Characterization of molecular and functional consequences of somatic NF1 mutations in non- small cell lung cancers


  • Résumé

    Driver molecular alterations are found in >40% of non-small cell lung cancers (NSCLCs). They specifically target the RAS-MAPK pathway, including the EGFR, KRAS, and BRAF oncogenes. NF1 is a tumor suppressor gene that encodes neurofibromin, an inhibitor of the RAS-MAPK pathway. NF1 mutation detection is challenging owing to the large size of the gene, the presence of numerous pseudogenes, and the absence of mutation hotspot. Recent studies showed that NF1 is a major tumor suppressor gene implicated in carcinogenesis. According to The Cancer Genome Atlas data (TCGA), NF1 somatic mutations are found in ~15% of lung cancer. However, NF1 mutations in NSCLCs are not extensively explored in NSCLCs to date. We hypothesized that NF1 alterations could define a specific NSCLC subtype with distinct clinical and molecular profiles. We performed NF1 analysis using next generation sequencing (NGS) in lung adenocarcinoma surgical specimens with known KRAS, EGFR, TP53, BRAF, HER2, and PIK3CA status. We evaluated the molecular and clinical specificities of NF1 mutated NSCLCs. Then, we established NF1-mutated cellular models from different NF1 wild-type (WT) cell lines, using the CRISPR-Cas9 system. Mono- and bi-allelic NF1 mutations were generated using CRISPR-Cas9 and nickase CRISPR-Cas9 technologies. In vitro functional tests and drug screening were performed using these isogenic cell models. In our series of 138 lung adenocarcinoma specimens, 25 tumours showed NF1 mutations (18%) and 11 showed NF1 deletions (8%). NF1 mutations were rarely associated with other mutations. Most of patients with NF1 alterations were males (72%) and smokers (75%). Overall survival and disease-free survival were statistically better in patients with NF1 alterations patients (N=35) than in KRAS mutated patients (N=30) in univariate analysis. There were more NF1 mutations in patients treated by neoadjuvant chemotherapy (p = 0.01). Then, we established cellular models of NF1-mutated NSCLCs, using nickase and CRISPR-Cas9 technology. Mono- and bi-allelic NF1 mutations were generated. Loss of NF1 expression was confirmed by western blot: partial and total loss-of-expression of neurofibromin was found in mono-allelic and bi-allelic NF1 mutated cell lines, respectively. Using western blot, we showed that pERK/ERK ratio was higher in NF1-mutated cell lines versus WT cell lines, confirming that NF1 loss-of-function triggered RAS-MAPK pathway activation. Homozygous NF1 mutated cells seemed to be more aggressive in vitro compared to heterozygous and WT mutated cells, using migration, invasion, and proliferation tests. Transcriptome analysis confirmed that WT, heterozygous, and homozygous NF1 mutations defined distinct clusters. WT and NF1 heterozygous clones showed closer transcriptional profiles. In vitro pharmacological screens in this isogenic NSCLC model are ongoing using MEK and PIK3CA inhibitors alone and in combination. In vivo pharmacological screen will also be performed on murine PDX models. Our results confirm that NF1 is frequently mutated and represents a distinct molecular and clinical subtype of NSCLCs. A better comprehension of functional consequences of NF1 mutations, including mono- and bi-allelic alterations, may open new avenues for NSCLCs therapy.

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