Rôle des phosphatases au cours du cycle érythrocytaire du parasite responsable du paludisme humain Plasmodium falciparum.

Role of the phosphatases over the erythrocytic cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum

• Auteur / Autrice : Alexandra Victoria Miliu
• Direction : Mauld Lamarque, Catherine Braun-Breton
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 29/11/2018
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques (Montpellier)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mauld Lamarque, Catherine Braun-Breton, Jamal Khalife, Hans Peter Beck, Marie-France Cesbron-Delauw
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jamal Khalife, Hans Peter Beck

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phosphatases

Phosphorylation

Paludisme

Plasmodium falciparum

Mots clés libres

Plasmodium

Paludisme

Phosphorylation

Phosphatases

Egress

Schizogonie

Plasmodium

Malaria

Phosphorylation

Phosphatases

Egress

Schizogony

Résumé

Plasmodium falciparum, l'agent étiologique du paludisme, est un parasite intracellulaire obligatoire du phylum des Apicomplexa, responsable de 445 000 décès par an. Le développement de Plasmodium dans les globules rouges (GRs) humains correspond à la phase symptomatique de la maladie. Il commence par la pénétration active de la cellule hôte par la forme invasive nommée mérozoïte, suivie par la multiplication du parasite dans un processus appelé schizogonie pour former 16 à 32 nouveaux mérozoïtes qui sont alors libérés des GRs (étape de sortie) et peuvent alors initier un nouveau cycle. Au cours de son développement intra-érythrocytaire de 48h, ce parasite utilise la phosphorylation réversible de protéines pour réguler les étapes d‘invasion, de schizogonie et de sortie du GR, mais nos connaissances actuelles sur la contribution des phosphatases parasitaires dans ces mécanismes demeurent très incomplètes.L'objectif de ma thèse était d’identifier et de caractériser des phosphatases potentiellement impliquées dans la sortie ou l'invasion des GRs par P. falciparum. J'ai centré mon travail sur 4 d'entre elles, à savoir PP1, PP4, PP7 et Shelph2, sur la base de leur profil d'expression transcriptionnelle tardive au cours du cycle intra-érythrocytaire, qui correspond à ces deux évènements cellulaires. La première partie de cette étude est consacrée à la caractérisation fonctionnelle de Shelph2, une phosphatase d'origine bactérienne. Par génétique inverse utilisant la stratégie CRISPR-Cas9, nous avons étiqueté le gène au locus endogène et montré que Shelph2 est stockée dans des vésicules apicales des mérozoïtes en formation. Nous avons également démontré que cette phoshpatase n’est pas essentielle pour le développement intra-érytrocytaire du parasite dans les GRs car la délétion du gène n'affecte pas les étapes d'invasion, de multiplication des parasites ou de leur sortie des GRs, ce qui suggère la possibilité d’une redondance fonctionnelle avec d'autres phosphatases parasitaires.Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons cherché à décrire les rôles de PP1, PP4 et PP7. Les gènes codant pour ces enzymes étant décrits comme probablement essentiels, nous avons mis en place au laboratoire une stratégie de knock-down conditionnel (ribozyme glmS), avec l’idée de déstabiliser l’ARNm après auto-clivage du ribozyme lors de l’addition d‘un métabolite, ici la glucosamine. Nous avons introduit avec succès la séquence glmS en 3 'des gènes d’intérêt pour PP4 et PP7, mais nous n’avons pas observé de déplétion protéique significative lors de l’addition de glucosamine, empêchant d’utiliser ces lignées pour étudier les fonctions de PP4 et PP7. Cependant, ces lignées parasitaires modifiées ont été utilisées pour analyser la localisation subcellulaire de ces phosphatases. Comme alternative au ribozyme, nous avons utilisé une approche de knock-out inductible (iKO) basée sur une recombinase Cre dimérisable (système DiCre) qui excise des fragments d'ADN situés entre deux sites loxP. Nous avons établi deux lignées de parasites, iKO-PP7 qui n'a pas encore été caractérisée et la souche iKO-PP1. En utilisant les parasites iKO-PP1, nous avons montré que PP1 était principalement une phosphatase cytosolique majoritairement exprimée au stade schizontes. De plus, l'excision inductible du gène PP1 à deux moments différents du cycle érythrocytaire de P. falciparum nous a permis de révéler que PP1 joue deux rôles essentiels, l'un pendant la schizogonie et l'autre au moment de la sortie du parasite. A notre connaissance, ce travail représente la première description d'une phosphatase parasitaire requise pour ces étapes du développement asexué de P. falciparum.

Plasmodium falciparum, the etiologic agent of malaria, is an obligate intracellular parasite of the Apicomplexa phylum that is responsible for 445000 deaths annually. Plasmodium development in human red blood cells (RBCs) corresponds to the symptomatic phase of the disease. It starts by the active penetration of the host cell by the invasive form named merozoite, followed by the parasite multiplication in a process called schizogony to form 16-32 new merozoites that are released from the RBC (egress step) and start a new cycle. During its 48h intra-erythrocytic development, this parasite uses reversible protein phosphorylation to regulate invasion, schizogony as well as egress, but our current knowledge on the contribution of parasite phosphatases in these cellular events is still very poor. The objective of my thesis was to identify and functionally characterize phosphatases potentially involved in egress or invasion during P. falciparum RBC cycle. I focused my work on 4 of them, namely PP1, PP4, PP7 and Shelph2, on the basis of their late transcriptional expression profile during the intra-erythrocytic cycle, as this profile matches the timing of these two essential events. The first part of this study is dedicated to the functional characterization of Shelph2, a phosphatase of bacterial origin. By reverse genetics using CRISPR-Cas9 strategy, we endogenously tagged the gene, and showed that Shelph2 is stored in apical vesicles in the developing merozoites. We also demonstrated that it is dispensable for parasite RBC development, as the deletion of the gene did not affect invasion, parasite multiplication nor egress, suggesting possible functional redundancy with other parasite phosphatases.In the second part of this work, we aimed to describe the roles of PP1, PP4 and PP7. As they were described as likely essential, we set up in the laboratory a conditional knock-down strategy named the glmS ribozyme, with the idea of destabilizing the mRNA following self-cleavage of the ribozyme upon metabolite addition, here glucosamine. We successfully introduced the glmS sequence in 3’ of the genes of interest for PP4 and PP7 but we did not observe any significant protein depletion upon glucosamine addition, thus preventing us to use these lines to study PP4 and PP7 functions. Yet, these engineered parasite lines were used to analyze the subcellular localization of these phosphatases. As an alternative to the ribozyme, we used an inducible knock-out (iKO) approach based on a dimerizable Cre recombinase (DiCre system) that excises DNA fragments located between two loxP sites. We established two parasite lines, the iKO-PP7 that has not been further characterized and the iKO-PP1 strain. Using the iKO-PP1 parasites, we showed that PP1 is predominantly a cytosolic phosphatase mostly expressed during schizogony. Furthermore, the inducible excision of PP1 gene at two different time points of P. falciparum RBC cycle permitted us to reveal that PP1 plays two essential roles, one during schizogony and the other one at the time of parasite egress. This is to our knowledge the first description of a parasite phosphatase required for these developmental steps.