Synthèse et propriétés d’ARNs modifiés en position 2’ via des ponts disulfures

Synthesis and properties of 2’-O-modified RNAs bearing disulfide-containing groups

• Auteur / Autrice : Florian Gauthier
• Direction : Françoise Debart
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie biomoléculaire
• Date : Soutenance le 30/11/2018
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Chimiques (Montpellier ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Biomolécules Max Mousseron (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Jacques Vasseur
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Françoise Debart, Jean-Jacques Vasseur, Anthony Romieu, Sylvie Pochet, Christelle Dupouy, Benoît Michel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anthony Romieu, Sylvie Pochet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Doxorubicine

ARN interférence

ARN

Mots clés libres

Oligoribonucléotide

Ponts disulfures

Prodrogues de siARN

Liens auto-immolables

Conjugaison

Hairpin

Oligoribonucleotide

Disulfide bridge

SiRNA prodrug

Self-Immolative linker

Conjugation

Hairpin

Résumé

Les ARNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques et peuvent adopter des structures secondaires différentes. Par leurs propriétés, ils constituent des outils biologiques puissants pour des applications diverses, tels les ARNs interférents (siARN) qui permettent l’extinction de l’expression des gènes par exemple. L’introduction de modifications sur des ARNs s’est avérée essentielle pour améliorer leurs propriétés et faciliter l’étude de leurs rôles biologiques et leurs applications thérapeutiques.Ce manuscrit rapporte la synthèse et les propriétés d’ARNs modifiés en position 2’ du ribose par des groupements contenant des ponts disulfures, sensibles à un environnement réducteur.Dans la première partie, la synthèse de prodrogues de siARNs partiellement modifiés par des groupements benzyldithiométhyles est décrite. Leurs stabilités thermiques et enzymatiques, ainsi que leur démasquage en milieu réducteur, sont montrés. Les résultats prometteurs d’activité inhibitrice et de pénétration cellulaire, sur une lignée cellulaire du sarcome d’Ewing, permettent d'envisager une application potentielle de ces siARNs modifiés comme outils thérapeutiques.La deuxième partie décrit une approche de co-délivrance par des siARNs couplés avec une drogue anticancéreuse, la doxorubicine, via un lien auto-immolable contenant des ponts disulfures. Les propriétés physico-chimiques des conjugués sont déterminées, et la libération du siARN et de la drogue en milieu réducteur est mise en évidence.La troisième partie présente une autre méthode de conjugaison en solution entre la position 2’ d’un ARN et des petites molécules (sucres, coumarine, biotine, acide désoxycholique, glutathion) via un pont disulfure. La synthèse des ARNs conjugués et leur devenir en milieu réducteur sont décrits.Dans la dernière partie, l’impact d’un lien avec un pont disulfure intrabrin entre les positions 2’ de deux nucléotides adjacents est étudié dans un duplex ou la partie boucle d’hairpins. L’influence du pont disulfure sur l’équilibre des conformations duplex et hairpin d’un ARN d’intérêt biologique est évaluée, en absence et en présence d’agents réducteurs. Une application en fluorescence d’une hairpin contrainte en tant que « molecular beacon » montre des utilisations potentielles de ce lien dans des outils pour étudier la conformation de structures secondaires d’ARNs ou dans des sondes pour détecter les agents réducteurs.

RNAs are involved in numerous biological processes and can adopt different secondary structures. Thanks to their properties, they are powerful biological tools for diverse applications, such as small interfering RNA (siRNA) for gene silencing. Modified RNAs have proven to be essential to improve their properties, and to facilitate the study of their biological and therapeutic functions.This manuscript reports the synthesis and properties of 2’-O-modified RNAs bearing disulfide-containing groups, sensitive to reductive environment.The first part describes the synthesis of siRNAs prodrugs bearing lipophilic benzyldithiomethyl groups. The thermal stability, the serum stability and the response to glutathione treatment of modified siRNAs are thoroughly investigated. The gene silencing and the gymnotic delivery of several siRNAs are assessed, and demonstrates promising results on Ewing’s sarcoma cell line.A second part concerns the co-delivery of siRNAs and a hydrophobic anti-cancer drug (doxorubicin) using a self-immolative spacer bearing disulfide bonds. The chemico-physical properties of these conjugates are determined and the recovery of native siRNA and doxorubicin in response to reductive treatment is highlighted.A third part presents the conjugation of RNAs to small molecules (sugars, coumarin, biotin, deoxycholic acid, glutathione) using disulfide linkages. The synthesis of the RNA conjugates and their release in reducing conditions are also demonstrated.The last part reports the synthesis and the impact of an intrastrand dimethylene disulfide bridge between 2’-O-positions of two adjacent nucleotides in an RNA duplex and in the loop of RNA hairpins. Then, the influence of this linkage on the folding of a biologically relevant RNA structure is reported. Finally, an application of a constrained hairpin as a fluorescent molecular beacon highlights its potential use in tools for understanding RNA folding and in probes for the detection of reducing reagents