Effets antiviraux de l'agonisation des Toll-like Récepteurs dans les cellules du foie, une nouvelle stratégie immunothérapeutique dans la lutte contre HBV

par Ludovic Aillot

Thèse de doctorat en Infectiologie

Sous la direction de David Durantel.

Soutenue le 07-09-2018

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon) , en partenariat avec Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) et de Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon (laboratoire) .

Le président du jury était Mathias Faure.

Le jury était composé de David Durantel, Caroline Aspord.

Les rapporteurs étaient Lena Alexopoulou, Ivan Hirsch.


  • Résumé

    Le virus de l'hépatite B (HBV) infecte chroniquement près de 240 millions d'individus dans le monde. L'infection chronique par HBV est un souci de santé publique majeur puisque l'infection peut évoluer au cours du temps vers la cirrhose et/ou l'hépatocarcinome (CHC). Malgré l'existence de traitements efficaces à base d'analogues de nucléos(t)ides permettant de diminuer la charge virale chez les patients, ceux-ci nécessitent une prise médicamenteuse à vie. En effet, malgré la diminution importante du risque de développer un cancer du foie, ces traitements ne permettent pas l'élimination définitive du virus. Les cellules infectées par HBV sont les hépatocytes du foie, qui remplissent la majorité des rôles vitaux de cet organe. La formation d'un minichromosome viral au sein de ces cellules infectées appelés ADNccc (pour ADN circulaire-covalemment-clos), est majoritairement responsable de la persistance du HBV. Les traitements actuels utilisés sont principalement des analogues de nucléos(t)ides et ceux-ci n'ont pas ou peu d'effets sur l'ADNccc. La nécessité de développer de nouvelles stratégies antivirales visant à éliminer définitivement HBV a donc conduit de nombreux laboratoires, dont le nôtre, à étudier l'utilisation de stratégies immuno-thérapeutiques incluant des stimulateurs de l'immunité innée (agonistes de TLR7, TLR8, RIG-1.) dans le cadre d'infections chroniques. De nombreuses études ont démontré que l'utilisation de ligands stimulant les récepteurs de l'immunité innée promouvait un fort effet antiviral, médié par la production endogène et locale de cytokines pro-inflammatoires et l'induction de gènes régulés par l'interféron (1SG). Dans ce but, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux potentiels effets antiviraux de l'agonisation des senseurs de l'immunité innée les plus connus, les Toll-like récepteurs (TLR), dans le cadre de l'infection par HBV dans les cellules hépatiques. La stratégie immuno-thérapeutique envisagée, vise à stimuler aussi bien les cellules immunitaires que les hépatocytes infectés. La caractérisation de l'expression de différents senseurs de l'immunité innée, d'une part dans les cellules primaires isolées du foie et d'autre part dans certaines lignées cellulaires correspondantes, nous a permis d'avoir une vue d'ensemble 1) des récepteurs exprimés par les différentes cellules du foie notamment dans les hépatocytes (TLR2/TLR3/TLR4/TLR5) ; 2) d'évaluer la fonctionnalité de ceux-ci pour la production de cytokines (IL-6 ; IP-10) lors de leur agonisation 3) d'évaluer les modèles disponibles parmi les lignées cellulaires les plus proches immunologiquement des cellules hépatiques. Les cellules HepaRG et une nouvelle lignée dérivée des macrophages du foie les iKC par exemple sont plus proches respectivement des hépatocytes et des macrophages primaires hépatiques et sont donc des modèles relevant pour les études immuno-thérapeutiques. L'utilisation de ligands de TLR2 et TLR3 sur des hépatocytes infectés chroniquement par HBV, a montré le plus fort effet antiviral (incluant une médiation par la sécrétion de cytokines et l'induction d'1SG) aussi bien sur la réplication d'HBV que sur l'ADNccc. De plus, cet effet semble stable au cours du temps sans résurgence massive de productions virales. Cette stratégie cible non seulement les hépatocytes infectés, mais également les cellules immunitaires dont les productions cytokiniques ont également un fort effet antiviral. Bien que l'effet in vivo, dans un modèle murin, ait été plus modeste, un ajustement des doses d'agonistes utilisées ainsi qu'un meilleur moyen de délivrance au foie de ligands de TLR2 ou TLR3 pourraient être une stratégie immuno-thérapeutique intéressante. Enfin nous nous sommes intéressés au cas particulier de l'agonisation du TLR9 en présence d'HBV… [etc]

  • Titre traduit

    Antiviral effects by Toll-like receptors agonisation in liver cells, a new immunotherapeuticstrategy in the fight against HBV


  • Résumé

    HBV chronically infects 240 million peoples around the world. HBV chronic infection is a major public health problem and can lead to cirrhosis or/and hepatocarcinoma (HCC). Even if some efficient treatments are already available, based in particular on the use of nucleos(t)ides analogues that induce a decrease of viral load in patients, these drugs do not lead to a definitive HBV cure They enable an important decrease of liver cancer risk but need to be taken life-long. HBV infects hepatocytes the major liver cells which are involve in many vital mechanisms into the organism. The HBV minichromosome, which is formed into infected cells also called cccDNA (i.e., covalently-closed-circular DNA), is not affected by nucleos(t)ides treatments and thus is responsible for HBV persistence. The use of immune receptors (e.g. Toll-like receptors/TLR) agonists can lead to 1) an important cytokines/interferon (IFN) secretion; 2) promote immune cells activation/recruitment and 3) induction of many Interferon-Stimulated Genes (ISG). These mechanisms could lead to a greater viral clearance by cccDNA degradation or silencing. The need for new strategies to permanently eliminate HBV infection led many laboratories, including ours, to explore the use of immunotherapeutic treatments in a context of chronic infection, including innate immune stimulators (e.g. TLR7, TLR8 or RIG-I agonist are under clinical trials). To this end, we got interested on the potential anti-HBV effects of many TLR agonists in liver cells. Our strategy is to stimulate both infected hepatocytes and immune cells. We first characterized the expression of innate immune sensors in primary liver cells as well as in some liver cell lines. This allowed us to: 1) identify which sensors are expressed by liver cells, especially in hepatocytes (TLR2, TLR3, TLR4, TLR5); 2) evaluate their ability to produce cytokines (IL-6, IP-10) upon agonisation; 3) evaluation of cell lines model which are immunologically closed to the primary liver cells. HepaRG and a new liver macrophage cell line call iKC are immunologically close to their primary cells and appear to be relevant models for immune-therapeutics studies. The use of TLR2 and TLR3 agonists on HBV chronically infected hepatocytes showed a strong antiviral effect (i.e., decrease of HBV replication and cccDNA level) mediated directly by NF- kB-inducible and ISG genes activation and indirectly by cytokines secretion. Furthermore, this effect was shown stable over time without any viral replication rebound. This strategy targets not only infected hepatocytes but also immune cells, whose cytokines production also has a strong antiviral effect. Despite a weak in vivo effect in mice, a tuning in agonist doses used and better liver delivery could be an interesting immune-therapeutic strategy. Finally, we were investigated the particular case of TLR9 agonisation in presence of HBV. We showed an interaction between synthetic or not DNA ligands such as CpG ODN and HBV particles. This interaction leads in one hand, to HBV entry inhibition in hepatocytes, on the other hand, to a blockage of ligand delivery to TLR9 in pDC, which is not due to an inhibition of the TLR9 pathway, but to a lack of access of the ligand to its receptor. These two mechanisms are responsible for a decrease of viral infection during its establishment and a decrease in IFN synthesis by pDC, respectively. A decrease in IFN production, which this time was linked to a bona fide inhibition of the TLR9 pathway, in the presence of the sub-viral particles HBsAg was still observed, without retention of TLR9 ligand of the latter. It would seem, therefore, that use of TLR agonists represent an interesting strategy in setting up new anti-HBV immune-therapeutic approaches. However, their improvement will depend on the evaluation of viro-induced inhibitory mechanisms as well as better ways of in vivo delivering these ligands


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