Développement d’outils ultra-performants de criblage enzymatique de produits naturels par électrophorèse capillaire

Development of high-performance tools for enzymatic screening of natural products by capillary electrophoresis

• Auteur / Autrice : Syntia Fayad
• Direction : Philippe Morin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 18/12/2017
• Etablissement(s) : Orléans
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie organique et analytique (Orléans ; 2012-....)
• Jury : Président / Présidente : Luigi A. Agrofoglio
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Morin, Luigi A. Agrofoglio, Catherine Perrin, Yannis François, Myriam Taverna, Reine Nehmé, Franck Himbert
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Catherine Perrin, Yannis François

Mots clés

Mots clés contrôlés

Électroporation

Thermophorèse

Cinétique enzymatique

Élastases

Électrophorèse capillaire

Phytocosmétiques

Peau

Cosmétologie

Biomolécules actives

Mots clés libres

Essais enzymatiques

Electrophorèse capillaire

Fluorescence induite par laser

Spectrométrie de masse à haute résolution

Electroporation

Thermophorèse à micro-échelle

Peau

Extraits de plante

Enzymatic assays

Capillary electrophoresis

Laser induced fluorescence

High resolution mass spectrometry

Electroporation

Microscale thermophoresis

Skin

Plant extracts

Résumé

Le vieillissement de la peau est l'un des signes extérieurs du passage du temps. Avec l’âge, la peau devient plus sèche et se ride suite à la dégradation des macromolécules de la matrice extracellulaire par des enzymes cutanées telles que l’élastase, l’hyaluronidase et la collagénase. L’objectif de ce travail de thèse est de développer des tests enzymatiques miniaturisés en électrophorèse capillaire pour cribler des extraits de plantes et identifier de nouveaux bioactifs pour la cosmétique et le bienêtre de la peau. Ces essais ont été développés soit en dehors du capillaire (qui sert uniquement de milieu de séparation) ou dans le capillaire (qui sert alors de nanoréacteur enzymatique), puis optimisés pour permettre la détermination des constantes cinétiques (Km, Vmax et IC₅₀). La diffusion transversale des réactifs (TDLFP) a été appliquée pour mélanger les créneaux de réactifs injectés dans le capillaire. Des détecteurs tels que la fluorescence induite par laser ou la spectrométrie de masse à haute résolution ont été couplés à l’électrophorèse capillaire afin d’atteindre de fortes sensibilités de détection et la possibilité d’identifier les produits de la réaction enzymatique. Ces essais miniaturisés ont été appliqués à des algues extraites par électroporation ou à des plantes régionales extraites par des technologies vertes afin d’évaluer leur activité biologique vis-à-vis des enzymes de la peau. Les essais développés sont fiables, robustes et économes en réactifs. Enfin, l’utilisation d’une nouvelle technique d’analyse, la thermophorèse à micro-échelle, s’est montrée très utile et pleine d’espoir pour l’étude des interactions enzyme-effecteur.

Skin aging is one of the exterior/external signs of the passage of time. With age, the skin becomes drier and gets wrinkled due to the degradation of macromolecules of the extracellular matrix by skin enzymes such as elastase, hyaluronidase and collagenase. The aim of this thesis is to develop miniaturized enzymatic assays by capillary electrophoresis to screen plant extracts and identify new bioactives for cosmetics and skin wellbeing. These assays were developed either outside the capillary (which serves only as a separation tool) or in the capillary (which then serves as an enzymatic nanoreactor) then optimized to allow the determination of kinetic constants (Km, Vmax and IC₅₀). Tranvserse diffusion of laminar flow profiles (TDLFP) was applied to mix the reactants injected into the capillary. Detectors such as laser-induced fluorescence or high-resolution mass spectrometry have been coupled to capillary electrophoresis to achieve high sensitivities of detection and the possibility of identifying the products of the enzymatic reaction. These miniaturized assays were applied to algae extracted by electroporation or to regional plants extracted by green technologies in order to evaluate their biological activity towards skin enzymes. The assays developed are reliable, robust and economic in reactants consumption. Finally, the use of a new analytical technique, microscale thermophoresis, was shown to be very useful and hopeful for the study of enzyme-effector interactions.