Caractérisation fonctionnelle de formes mutées du récepteur des dihydropyridines responsables de Paralysie Périodique Hypokaliémique de type 1

par Clarisse Fuster

Thèse de doctorat en Physiologie

Sous la direction de Bruno Allard.

Soutenue le 08-12-2017

à Lyon , dans le cadre de École Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé. (Villeurbanne) , en partenariat avec Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) et de Institut NeuroMyoGène (laboratoire) .

Le président du jury était Pierre Charnet.

Le jury était composé de Maëlle Jospin.

Les rapporteurs étaient Sophie Nicole, Michel Vivaudou.


  • Résumé

    La Paralysie Périodique Hypokaliémique de type 1 (HypoPP1) est une myopathie d'origine génétique, autosomique dominante, caractérisées par des épisodes de paralysies musculaires récurrentes pouvant durer quelques heures à quelques jours. Ces crises de paralysies sont accompagnées d'une hypokaliémie responsable d'arythmies cardiaques entraînant la mort dans les cas les plus graves. Les crises peuvent être déclenchées par un stress, une alimentation riche en glucides ou encore suite à un exercice physique intense. L'HypoPP1 est liée à une mutation dans le gène CACNA1S codant la sous-unité principale du canal calcique musculaire (Cav1.1). A l'exception d'une, toutes les mutations HypoPP1 conduisent au remplacement d'une des arginines les plus externes d'un des segments détecteurs de potentiel du canal, nommés S4, par un acide aminé neutre. Des études réalisées dans des modèles d'expression hétérologue de canaux potassiques ou sodiques, dont les structures sont très proches du Cav1.1, ont montré que des mutations similaires à l'HypoPP1 conduisaient à la création d'une voie de passage ionique dite "accessoire" au travers du domaine détecteur de potentiel générant un courant cationique entrant au potentiel de repos. Si une telle voie de passage ionique existe à travers Cav1.1 dans les cellules musculaires des patients souffrant d'HypoPP1, elle pourrait ainsi induire une dépolarisation des cellules musculaires au point de les rendre inexcitables, conduisant ainsi à la paralysie. Mon travail a consisté à étudier les formes R1239H et V876E du Cav1.1 responsables d'HypoPP1 afin de déterminer si une telle voie de passage accessoire est présente dans les canaux calciques mutés. La mutation R1239H correspond à la substitution d'une histidine à la seconde arginine dans le segment S4 du domaine IV tandis que la mutation V876E présente la particularité de ne pas affecter un S4 mais un segment S3 dans le domaine III. Ce travail s'appuie sur l'expression in vivo du gène codant le Cav1.1 humain sain (WT) ou muté R1239H ou V876E dans les muscles des pattes arrière de souris puis sur l'analyse des mouvements ioniques en combinant des techniques d'électrophysiologie et de mesure des concentrations intracellulaires de H+ ou de Na+ par fluorescence sur fibre musculaire isolée. L'étude de la mutation R1239H a montré qu'un influx de protons générant un courant entrant significativement plus important se développait au potentiel de repos dans les fibres exprimant la mutation en comparaison des cellules exprimant la forme WT. L'étude de la deuxième mutation V876E, sur laquelle aucune donnée fonctionnelle n'était disponible à ce jour, a révélé que cette mutation était elle aussi responsable d'un courant ionique accessoire mais dans ce cas-là porté par les ions Na+. Ce résultat est important car il montre que la formation d'un pore ionique accessoire constitue un mécanisme physiopathologique commun à différentes formes d'HypoPP affectant le canal calcique musculaire, y compris lorsque la mutation n'affecte pas directement un segment S4

  • Titre traduit

    Functionnal charaterization of mutant form of dihydropyridine receptors causing type 1 Hypokalemic Periodic Paralysis


  • Résumé

    The type 1 Hypokalemic Periodic Paralysis (HypoPP1) is a muscle autosomal dominant genetic disease characterized by episodic attacks of paralysis lasting between a few hours and several days. These attacks are associated with hypokalemia which is responsible of cardiac arrhythmias leading to death in worst cases. Attacks are triggered by stress, high carbohydrate diet or during rest following exercise. HypoPP1 is caused by missense mutations in the gene CACNA1S encoding the main subunit of the voltage-gated calcium channel (Cav1.1) of skeletal muscle. In all but one, HypoPP1 mutations lead to the replacement of an outermost arginine in one of the voltage sensor segment, called S4, with a neutral amino-acid. Experiments realized with the closely structurally related voltage-gated K+ and Na+ channels showed that comparable mutations generate an accessory pathtoway called gating pore through which a depolarizing current flows at rest. If such an accessory pathway also exists in the skeletal muscle Cav1.1, it could initiate depolarization of skeletal muscle to the point of inexcitability and lead to paralysis. My work aimed at investigating the properties of HypoPP1-associated mutant Cav1.1s R1239H and V876E in order to determine if such an accessory pathway could be present in mutated Cav1.1. The R1239H mutation corresponds to the replacement of the second arginine in the S4 segment of domain IV by a histidine and the V876E mutation has the particularity to not affect a S4 segment but the S3 segment in domain III. In this work, we used in vivo gene expression of the wild type (WT) or mutated forms of the human Cav1.1in the hind limb muscle of mice and analyzed ions fluxes by combining voltage-clamp and measurements of intracellular H+ or Na+ by fluorescence. The R1239H mutation was shown to induce a significant larger H+ influx giving rise to a larger inward H+ current at rest as compared to WT. The V876E mutation, which had never been investigated so far, was found to induce an elevated inward current at rest but in this case carried by Na+ ions. These results have relevance because they suggest that the presence of an accessory pathway could be a physiopathological mechanism shared by different HypoPPs, even when the mutation does not directly affect a S4 segment


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