Caractérisation de la différenciation de l'endoderme primitif : Coopération entre la voie de signalisation RTK-FGF et le facteur de transcription Gata 6

Characterization of the differentiation of the primary endoderm : Cooperation between the RTK-FGF signalling pathway and the GATA6 transcription factor

• Auteur / Autrice : Stephanie Hermitte
• Direction : Claire Chazaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la sante
• Date : Soutenance le 23/10/2017
• Etablissement(s) : Université Clermont Auvergne‎ (2017-2020)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences de la vie, santé, agronomie, environnement (Clermont-Ferrand)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique, Reproduction et Développement (Clermont-Ferrand)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Arnaud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Arnaud, Hélène Boeuf, Michel Cohen-Tannoudji, Anne Fogli
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fabrice Lavial

Mots clés

Mots clés contrôlés

Endoderme (embryologie)

Mots clés libres

La voie RTK-FGF

Gènes Sox17

Endoderme

The RTK-FGF channel

Sox17 genes

Endoderm

Résumé

A E3.5 jours de développement (E3.5), l’embryon murin se compose d’une monocouche de cellules externes correspondant au Trophectoderme (TE) et d’une masse cellulaire interne (MCI), hétérogène, constituée de deux sous-populations de cellules précurseurs : les cellules épiblastiques (Epi) et les cellules d’endoderme primitif (EPr). NANOG, marqueur épiblastique et GATA6, marqueur de l’EPr, sont co-exprimés à E3.5 dans la MCI puis adoptent une expression exclusive au sein de leur lignage respectif. La différenciation du lignage EPr nécessite l’expression de GATA6 et l’activation de la voie Récepteur Tyrosine Kinase (RTK) activée par le FGF (RTK-FGF) pour l’induction de gènes cibles de GATA6 tels que Sox17 et Gata4.Au cours de ma thèse, j’ai, dans un premier temps, étudié la relation GATA6/voie RTK-FGF lors de l’induction de l’expression des gènes de différenciation de l’EPr. J’ai utilisé des cellules souches embryonnaires murines ES sauvages ou mutantes pour Gata6 (ES Gata6-/-), dans lesquelles j’ai surexprimé différentes formes mutantes de Gata6 inactivées sur les différents résidus identifiés comme potentiellement phosphorylables par la voie RTK-FGF. Ainsi, j’ai analysé l’expression protéique des gènes Sox17 et Gata4 ainsi que des expressions ARN de ces cibles et d’autres gènes caractéristiques exprimés dans l’EPr dans les différentes conditions de surexpression des formes de Gata6 en absence ou présence d’inhibiteurs de la voie RTK-FGF. Ainsi, j’ai pu mettre en évidence que la transmission du signal s’effectue au travers de récepteur au FGF et qu’il existe une compensation entre les branches RTK-MEK-ERK et RTK-PI3K ciblant le résidu Sérine 37 de GATA6. Enfin, les résidus S34 et T509 sont nécessaires et les résidus S34, S37 et T509 semblent coopérer, au travers d’un mécanisme pour le moment non détaillé, pour l’induction des gènes cibles exprimés au sein de l’EPr.Dans un second temps, j’ai débuté la caractérisation phénotypique du rôle des facteurs Dickkopf1 (DKK1), un inhibiteur de la voie WNT/β-caténine, et NOGGIN, un inhibiteur de la voie des Bone Morphogenic Protein (BMP) lors de la différentiation de l’EPr en endoderme pariétal (EP) et viscéral (EV). A l’aide de modèles de souris KO pour DKK1 et NOGGIN, croisées en fond C57Bl6 pur, j’ai pu observer que l’expression d’OCT4 était maintenue au sein des embryons homozygotes mutants pour Dkk1 et double homozygotes mutants pour Dkk1 et Noggin. Cependant, le mécanisme potentiel de compensation ou de coopération de ces deux marqueurs n’est pour le moment pas détaillé précisément et mérite l’analyse d’un plus grand nombre d’embryons mutants.

At E3.5 days of development (E3.5), mouse embryo consists of a monolayer of external cells corresponding to Trophectoderme (TE) and of an intern cell mass (ICM), heterogeneous, constituted by two subpopulations of precursory cells: epiblastic cells (Epi) and primitive endoderm cells (EPr). NANOG, an Epi marker and GATA6, a PrE marker, are co-expressed at E3,5 in the MCI and then adopt an exclusive expression within their respective lineage. EPr differentiation requires both expression of GATA6 and RTK pathway, activated by FGF ligand, in order to induce late markers Sox17 and Gata4 expression.First, I studied the relation GATA6/RTK during this process to understand the mechanism of induction of these target genes during final EPr differentiation. I used embryonic stem cells ES WT or Gata6 mutants (ES Gata6-/-), in which I transfected various Gata6 mutant constructions on different residues characterized as potentially phosphorylable by the RTK pathway. So, I analyzed protein expression of Sox17 and Gata4 target genes as well as RNA expression of characteristic genes expressed in the EPr in different inhibition conditions of RTK pathway. So, I was able to highlight that the transmission of the signal is made through the FGF receptor (FGFR1) and that there is compensation between RTK-MEK-ERK and RTK-PI3K pathways highlighted by later Gata6 overexpression of certain mutant forms. Finally, residue S34, S37 and T509 seems to cooperate, through a mechanism not detailed for the moment, for the induction of the EPr target genes.Then, I was interested to phenotypically characterize the role of Dickkopf1 (DKK1), an inhibitor of the WNT/β-catenin pathway, and NOGGIN, an inhibitor of the Bone Morphogenic Protein (BMP) pathway during the EPr differentiation in parietal endoderm (EP) and visceral (EV). Using models of mouse KO for Dkk1 and Noggin, met in pure background C57Bl6, I was able to observe that OCT4 expression was maintained within the Dkk1-/-, and Dkk1-/- Noggin-/- embryos. However, the potential compensation or cooperation mechanism of these two markers is not understanding well for the moment and deserves the analysis of a largest mutant embryos number.