Détection et quantification d’acides nucléiques par l’intercalation de sondes électro-actives appliquée à l’intégration d’approches d’amplifications isothermes in vitro

Nucleic acids detection and quantification via electro-active probes intercalation applied to the integration of in-vitro isothermal amplification reactions

• Auteur / Autrice : Alexandra Martin
• Direction : Damien Marchal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie. Électrochimie moléculaire et biologique
• Date : Soutenance le 19/10/2016
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'Électrochimie Moléculaire (Paris) (1997-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Damien Baigl
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Damien Marchal, Damien Baigl, Stéphane Arbault, Thierry Livache, Christelle Hureau, Alain Pluquet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stéphane Arbault, Thierry Livache

Mots clés

Mots clés contrôlés

instrumentation

Techniques électrochimiques

diagnostic

Techniques in vitro

Réplication de séquence auto-entretenue

analyse

Acides nucléiques

PCR (génétique)

Mots clés libres

Systèmes analytiques intégrés

LAMP

Integrated analytical systems

LAMP

Résumé

Détection et quantification d’acides nucléiques par l’intercalation de sondes électro-actives appliquée à l’intégration d’approches d’amplifications isothermes in vitro. Détecter et quantifier la présence d’agents pathogènes à travers leur ADN représente un enjeu majeur dans de nombreux secteurs comme l’analyse biomédicale, l’agroalimentaire ou l’environnement. La technique de PCR optique en temps réel, couplant la réaction d’amplification génique in vitro dite PCR à une détection par fluorescence constitue la méthode standard pour réaliser ces analyses. Cependant, elle nécessite l’utilisation d’un thermocycleur et l’intégration d’une instrumentation optique rendant l’équipement onéreux et encombrant. De plus, les échantillons troubles ou colorés ne peuvent pas être traités. Pour remédier aux problèmes posés par l’optique, une méthode de suivi électrochimique de la PCR au moyen de sondes électroactives interagissant préférentiellement avec l’ADN double-brin a été développée au LEM. Un démonstrateur préindustriel réalisé en partenariat avec la start-up Easy Life Science permet la parallélisation des mesures de PCR électrochimique en temps réel dans les 48 cellules d’un consommable. Dans ce travail, la problématique de la régulation thermique est adressée en remplaçant la PCR par deux méthodes d’amplifications isothermes de l’ADN. La première d’entre elles, la LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification), particulièrement efficace et spécifique, est combinée à une détection électrochimique via l’utilisation d’un panel de sondes redox afin d’obtenir des performances analytiques rivalisant avec les méthodes optiques standards. Une seconde approche d’amplification isotherme présentant un schéma réactionnel plus simple que la LAMP, basée sur le recyclage des produits d’une HCR (Hybridization Chain Reaction), est également proposée. Enfin, un nouveau consommable miniaturisé intégrant, à ce jour, cent cellules électrochimiques de faible volume (≤ μL) ainsi que le potentiostat dédié sont présentés. L’originalité de ce consommable repose sur son processus de fabrication à très bas coût n’utilisant que des empilements de supports sérigraphiés. Fonctionnel à température ambiante, l’objectif à terme sera de l’utiliser pour des réactions d’amplifications isothermes dites « digitalisées »

Nucleic acids detection and quantification via electro-active probes intercalation applied to the integration of in-vitro isothermal amplification reactions. Detection and quantification of pathogenic agents through their DNA has become increasingly important in applications such as molecular diagnostics and food safety control to environmental monitoring. Routinely, these analyses are performed using optical quantitative PCR method by coupling the in vitro DNA amplification reaction PCR with fluorescent detection. However, it requires the use of a thermocycler as well as the integration of optical instrumentation leading to a bulky and expensive apparatus, unable to process turbid or colored samples. In order to circumvent these limitations, an alternative electrochemical monitoring method for PCR, based on the use of electro-active probes preferentially binding to double stranded DNA, has been proposed and developed at the LEM. A pre-industrial demonstrator developed in partnership with the start-up Easy Life Science allows the parallelization of real time electrochemical PCR measurements in a custom-made 48 wells plate. This work deals with the thermic regulation problem by replacing PCR by two alternatives isothermal DNA amplification methods. First, the LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification), known to be highly efficient and specific, is combined to an electrochemical detection through the use of a panel of redox probes in order to obtain analytical performances competing with the standard optical techniques. Secondly an isothermal amplification method with a simpler mechanism than LAMP, based on the recycling of the products of an HCR (Hybridization Chain Reaction), is also proposed. Finally, a new miniaturized plate integrating, to date, one hundred low volume (≤ μL) electrochemical cells as well as the corresponding potentiostat are presented. The novelty of this plate relies on its very low cost fabrication process based on the simple assembly of screen-printed films. Although the results presented were at room temperature, in the long term, it is envisioned to monitor isothermal amplification reactions in a “digital” manner