Etude du rôle d’ASXL2 dans l'hématopoïèse normale et pathologique

Role of ASXL2 in Normal and Malignant Hematopoiesis

• Auteur / Autrice : Jean-Baptiste Micol
• Direction : Éric Solary
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 23/03/2016
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hématopoïèse normale et pathologique (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-2019)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation de la thèse : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Martin Schlumberger
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Éric Solary, Martin Schlumberger, Estelle Duprez, David Grimwade, Omar Abdel Wahab, Jonathan Weitzman
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Estelle Duprez, David Grimwade

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épigénétique

Protéines du groupe Polycomb

Leucémie aigüe myéloïde

Mots clés libres

Asxl2

Hématopoïèse

Runx1/runx1t1

Leucemie aigue myeloide

Polycombe

Asxl1

Asxl2

Hematopoiesis

Runx1/runx1t1

Acute Myeloid leukemia

Polycomb

Asxl1

Résumé

Les gènes ASXL (ASXL1, ASXL2 et ASXL3) sont les homologues mammifères du gène Additional sex combs (Asx) présent chez la Drosophile. En 2009, des mutations somatiques impliquant ASXL1 ont été identifiées chez ~ 10-20% des patients atteints d’hémopathies myéloïdes. Le rôle et l’implication des autres membres de la famille dans l’hématopoïèse normale et pathologique sont encore inconnus.Dans ce travail, nous avons identifié pour la 1ère fois, par séquençage haut débit, des mutations somatiques récurrentes d’ASXL2 (22,7%) chez des adultes et enfants atteints de leucémies aiguës myéloïdes (LAM) avec translocation t(8 ;21) (c.-à-d AML1-ETO (AE) ou RUNX1/RUNX1T1). Ces mutations n’ont pas été retrouvées dans d’autres sous types de LAM et sont mutuellement exclusives des mutations d’ASXL1. Le séquençage de l'ARN (RNAseq) d'échantillons de patients a révélé un profil transcriptionnel spécifique chez les patients mutés pour ASXL2. Bien que la survie globale soit similaire, les patients porteurs de mutations d’ASXL1 ou ASXL2 ont une incidence cumulative de rechute de 54,6% et 36,0% comparativement à 25% pour les patients non mutés (P = 0,226). Ces résultats, évoquant une coopération entre ASXL1/2 et AE lors de la leucémogenèse, sont importants car les t(8 ;21) sont parmi les anomalies cytogénétiques les plus fréquentes en matière de LAM. D’autre part, il est bien établi que AE nécessite la coopération d’altérations géniques supplémentaires pour induire la leucémie.Nous avons ensuite exploré le rôle d’ASXL2 dans l’hématopoïèse normale. Nous avons d’abord démontré in vitro que les mutations d’ASXL2 entrainent une diminution de son expression. Nous avons ensuite généré un modèle de souris invalidées pour Asxl2 (KO conditionnel). Par transplantations compétitive et non compétitive, nous avons montré que le KO pour Asxl2 ou Asxl1 et Asxl2 (double KO) induit une diminution et un défaut d’auto renouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) ainsi que des cytopénies, avec un phénotype plus sévère que le KO d’Asxl1 seul. L’analyse du transcriptome (par RNAseq) des CSH a révélé un nombre de gènes dérégulés par la perte d’Asxl2 25 fois plus important qu’avec Asxl1. De plus les gènes dérégulés par la perte d’Asxl2 recoupent les cibles transcriptionnelles d’AML1-ETO. Ces données suggérant qu’Asxl2 pourrait être un médiateur important de la leucémogenèse, nous avons ensuite étudié le rôle d’ASXL2 dans les LAM avec t(8 ;21). In vitro, par CHIP Seq, nous avons mis en évidence, dans des lignées t(8;21), un enrichissement des sites de liaisons à l’ADN d’ASXL2 au niveau de ceux d’AML1-ETO. De plus, en infectant ces lignées avec un shRNA dirigé contre ASXL2, nous avons étudié la marque H3K4me1 qui est augmentée de façon majeure dans le contexte leucémique. Afin de comprendre les effets in vivo d’ASXL2 dans la leucémogenèse, nous avons réalisé des greffes de cellules de moelle osseuse de souris KO infectées avec un rétrovirus pour AE9a. Ces souris développent une LAM plus rapidement que les souris contrôles AE9a lors de greffes secondaires, suggérant à nouveau un rôle spécifique d’Asxl2. Afin d’élucider le mécanisme impliqué, nous avons réalisé de l’ATAC seq sur ces souris et mis en évidence des différences importantes dans l’accessibilité de la chromatine, notamment au niveau des gènes Hoxa et Meis1.Pour la première fois, nous décrivons l’incidence des mutations d’ASXL2 dans les LAM et le rôle d’ASXL2 dans l’hématopoïèse. Nous suggèrerons un rôle spécifique dans les LAM avec t(8;21), qui pourrait être associé à des modifications de la marque d’histone H3K4me1. Ces spécificités pourraient résulter en de nouvelles options thérapeutiques chez les patients.

The ASXL family of genes (ASXL1, ASXL2, and ASXL3) are mammalian homologs of the Drosophilia Additional sex combs (Asx) gene. In 2009 somatic mutations involving ASXL1 were originally identified in ~10-20% of patients with myeloid malignancies. Despite this association, alterations in other ASXL family members and their potential function in normal or malignant hematopoiesis were unknown.We identified, by next generation sequencing, the surprising finding of highly recurrent somatic ASXL2 mutations (22.7%) in adult and pediatric acute myeloid leukemia (AML) patients bearing the AML1-ETO (AE) translocation (i.e. RUNX1/RUNX1T1, t(8;21)). Interestingly these mutations were only found in patients with t(8 ;21) and mutually exclusive with ASXL1 mutations. RNA sequencing (RNAseq) of primary AE AML patient samples revealed that ASXL2-mutants form a distinct transcriptional subset of AE AML. Although overall survival was similar between ASXL1 and ASXL2 mutant t(8;21) AML patients and their wild-type counterparts, patients with ASXL1 or ASXL2 mutations had a cumulative incidence of relapse of 54.6% and 36.0%, respectively, compared with 25% in ASXL1/2 wild-type counterparts (P=0.226). These findings are of immediate biological importance as AE translocations are amongst the most common cytogenetic alterations in AML and it is well established that AE requires additional genetic alterations to induce leukemogenesis.Given the above human genetic data, we set out to perform a functional comparison of ASXL1 and ASXL2 on hematopoiesis and determine the functional basis for frequent mutations in AE AML. In vitro analyses of ASXL2 mutations revealed that these mutations resulted in substantial reduction of ASXL2 protein expression. We therefore generated Asxl2 conditional knockout (cKO) mice to delineate the effect of ASXL2 loss on hematopoiesis. Competitive and noncompetitive transplantation revealed that Asxl2 or compound Asxl1/2 loss resulted in cell-autonomous, rapid defects of hematopoietic stem cell (HSC) function, self-renewal, and number with peripheral blood leukopenia and thrombocytopenia. RNA-seq of HSCs revealed twenty-fold greater differentially expressed genes in Asxl2 cKO mice relative to Asxl1 cKO mice. Interestingly, genes differentially expressed with Asxl2 loss significantly overlapped with direct transcriptional targets of AE, findings not seen in Asxl1 cKO mice.Overall, the above data suggest that Asxl2 may be a critical mediator of AE leukemogenesis. To functionally interrogate the role of ASXL2 loss in leukemogenesis we first utilized an in vitro model with RNAi-mediated depletion of ASXL2 in the SKNO1 cell line. Anti-ASXL2 and AE ChIPSeq revealed significant co-occupancy of ASXL2 with AE binding sites. Moreover, analysis of histone modification ChIP-Seq revealed an enrichment in intergenic and enhancer H3K4me1 abundance following ASXL2 loss. Next, to understand the in vivo effects of Asxl2 loss in the context of AE, we performed retroviral bone marrow (BM) transplantation assays using AE9a in Asxl2 cKO mice. In contrast to the failure of HSC function with Asxl2 deletion alone, mice reconstituted with BM cells expressing AE9a in Asxl2-deficient background had a shortened leukemia-free survival compared to Asxl2-wildtype control. Moreover, ATAC Sequencing showed an increase of chromatin occupancy with Asxl2 loss at known leukemogenic loci, including the HoxA and Meis1 loci.Overall, these data reveal that ASXL2 is required for hematopoiesis and has differing biological and transcriptional functions from ASXL1. Moreover, this work identifies ASXL2 as a novel mediator of AE transcriptional function and provides a new model of penetrant AE AML based on genetic events found in a substantial proportion of t(8;21) AML patients. Further interrogation of the enhancer alterations generated by ASXL2 loss in AE AML may highlight new therapeutic approaches for this subset of AML