Etude et développement de nouveaux additifs peptidiques capables de promouvoir l’entrée des vecteurs lentiviraux de thérapie génique dans les cellules cibles

Study and development of new culture additives capable to promote the entry of lentiviral vectors for gene therapy on target cells

• Auteur / Autrice : Saliha Majdoul
• Direction : David Fenard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 30/11/2016
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Approches génétiques intégrées et nouvelles thérapies pour les maladies rares (Evry, Essonne)
• Jury : Président / Présidente : Francisco Javier Perea
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Otto-Wilhelm Merten, Antoine Kichler
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Lucile Espert, Els Verhoeyen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transduction

Autophagie

Thérapie génique

Cellules souches hématopoïétiques

Mots clés libres

Vecteurs lentiviraux

Additifs de culture

Résumé

Les vecteurs lentiviraux (LVs) dérivés du virus de l’immunodéficience humaine de type I (VIH-1) sont des outils efficaces de transfert de gène, largement utilisés en thérapie génique, en particulier pour la transduction ex vivo de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (CSPHs). Cette thèse porte sur la caractérisation de deux nouveaux additifs de culture permettant de promouvoir l’entrée des LVs dans les cellules cibles : Vectofusin-1 et Tat-Beclin1. Dans un premier temps, mon travail a consisté à caractériser la structure-fonction de la nouvelle famille de Vectofusins, dérivés du peptide LAH4. Dans cette étude, Nous avons comparé l’efficacité de transduction des CSPHs en présence de différents mutants peptidiques de la Vectofusin-1. Nous avons montré que la Vectofusin-1 est le peptide le plus performant parmi tous les isomères de Vectofusin pour la transduction des CSPHs avec les pseudotypes VSV-G-LV et GALVTR-LV. Nos résultats montrent l’importance de (i) l’angle polaire à 140° formé par les résidus histidine dans la représentation de Schiffer-Edmundson, (ii) la présence de résidus lysine à l’extrémité N-terminale, et (iii) l’utilisation de leucines comme résidus hydrophobes. Ces paramètres cruciaux pour la fonction biologique des peptides de la famille Vectofusin nous permettent de mieux comprendre leur mécanisme d’action. Cette thèse porte également sur l’étude du nouvel additif de culture Tat-Beclin1, décrit dans la littérature comme étant un inducteur d’autophagie et un inhibiteur puissant de la réplication virale, en particulier du VIH-1. De façon surprenante, nous avons observé que l’utilisation de faibles doses de Tat-Beclin1 augmente fortement les niveaux de transduction de lignées cellulaires et de CSPHs en présence de divers pseudotypes LVs. Au sein de cette étude nous avons montré que ce peptide Tat-Beclin1 est compatible avec une application en thérapie génique grâce à l’absence de cytotoxicité que ce soit ex vivo ou in vivo lors de l’utilisation de modèle murin humanisé NSG pour la greffe de CSPHs. Le peptide Tat-Beclin1 agit au niveau de l’étape d’entrée, en potentialisant l’adhésion et la fusion virale, sans induire l’agrégation des particules virales. Des études du flux autophagique montrent que Tat-Beclin1 n’induit pas d’autophagie aux faibles doses utilisées. Ceci suggère que ce nouvel additif de culture agit à travers des voies moléculaires encore inconnues impliquant probablement des voies de signalisation intracellulaire indépendantes de l’autophagie. En conclusion, ce travail de thèse permet de décrire Tat-Beclin1 et Vectofusin-1 comme des nouveaux additifs de culture performants pour promouvoir la transduction de cellules cibles avec des LVs de thérapie génique.

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-derived Lentiviral vectors (LVs) are used for various gene transfer applications, notably hematopoietic gene therapy. Culture additives are necessary to promote an efficient entry of LVs into hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). This work highlights two culture additives: Vectofusin-1 and Tat-Beclin1. First, we studied the structure-function of the new family of culture additives derived from LAH4: Vectofusins. We designed Vectofusin-1 isomers and showed that Vectofusin-1 remains the lead peptide for HSPCs transduction enhancement with LVs pseudotyped with VSV-G and GALVTR envelope glycoproteins. By comparing the efficiency of numerous Vectofusin-1 mutants, it appeared the importance of (i) lysine residues on the N-terminal extremity of Vectofusin-1, (ii) a hydrophilic angle of 140° formed by histidine residues in the Schiffer-Edmundson helical wheel representation, and (iii) hydrophobic residues consisting of leucine are all essential and help to define a minimal active sequence leading to an optimal activity of the Vectofusin-1 peptide. This work also allowed the discovery of a new culture additive called Tat-Beclin1, previously described as an autophagy-inducer peptide and a powerful viral replication inhibitor, especially on HIV-1. In this study, we showed that the use of low doses of Tat-Beclin1 peptide strongly promotes the transduction of cell lines or HSPCs with LVs pseudotyped with various envelope glycoproteins. The use of low doses of Tat-Beclin1 peptide is compatible with a gene therapy application since these experiments showed no cytotoxic effect either ex vivo or in vivo using a humanized mice model of HSPCs engraftment. The Tat-Beclin1 peptide is acting on the viral entry, specifically on the adhesion and fusion steps, but without inducing any aggregation of the viral particles. Studies of the autophagic flux showed that Tat-Beclin1 is not inducing this pathway at the low doses tested. Therefore, Tat-Beclin1 is acting on LVs through signaling pathways that are still to be defined. In conclusion, Tat-Beclin1 and Vectofusin-1 peptides are performant and safe transduction enhancers for retrovirus-based vectors dedicated to gene therapy.