Oligosaccharide Diphosphodolichol (DLO) Diphosphatase : un régulateur potentiel des DLO

Dolichol linked Oligosaccharide Diphosphatase : a potential regulator of dolichol linked oligosaccharides

• Auteur / Autrice : Ahmad Massarweh
• Direction : Stuart Moore
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Science de la vie, biologie et santé
• Date : Soutenance le 11/10/2016
• Etablissement(s) : Paris 6
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physiologie, physiopathologie et thérapeutique
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche sur l'inflammation (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Gisèle Bonne
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Jacques Lacapère, Thierry Touzé
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Thierry Levade, Jamel El Benna

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dolichols

Appareil de Golgi

Réticulum endoplasmique

Mots clés libres

Réticulum endoplasmique

Appareil de Golgi

N-Glycosylation

Oligosaccharides phosphorylés

Alg12-Cdg

Bréfeldine A

Oligosaccharyl phosphates

Dolichol cycle

Golgi apparatus

Résumé

CONTEXTE: Les " Type I Congenital disorders of glycosylation " (CDG-I) comportent des déficits de biosynthèse de l'oligosaccharide lié au dolichol (DLO) qui est nécessaire pour la N-glycosylation des protéines. Ces déficits induisent : 1) une hypoglycosylation des protéines qui serait à l'origine de la pathologie ; et 2) une accumulation de DLO tronqués à partir desquels, par un mécanisme encore inconnu, des structures oligosaccharidiques libres phosphorylées (OSP) sont générées dans le cytosol. Afin de comprendre le rôle de ce processus dans le CDG, il était donc nécessaire de caractériser l'activité qui est à l'origine des OSP.RESULTATS: J'ai caractérisé biochimiquement une DLO diphosphatase (DLODP) qui génère des OSP et du dolichol phosphate à partir de DLO. L'activité DLODP co-fractionne avec un marqueur de l'appareil de Golgi (AG) mais pas avec les enzymes réticulaires qui utilisent le dolichol phosphate. Cette localisation inattendue de DLODP m'a conduit à étudier la génération des OSP dans les cellules en utilisant la bréfeldine A (BFA) qui fusionne l'AG avec le RE. La BFA ne modifie pas les taux de DLO tronqués ni ceux des OSP cytoplasmiques dans un modèle cellulaire de CDG-I. Cependant, dans ces cellules et dans les cellules témoins, la BFA induit une forte augmentation des OSP dans le système endomembranaire à partir de DLO non-tronqués.CONCLUSION: L'identification de différents pools d'OSP, topologiquement distincts et pouvant être modulés de façon indépendante, révèle la multiplicité des mécanismes pour la génération d'OSP et suggère que la DLODP Golgienne n'est pas forcément l'enzyme responsable de la génération des OSP dans le contexte de CDG-I.

BACKGROUND: Type I congenital disorders of glycosylation (CDG-I) are caused by genetic defects in the biosynthetic pathway for the dolichol-linked oligosaccharide (DLO) that is required for protein N-glycosylation. These mutations result in the accumulation of truncated DLO and protein hypoglycosylation. Although protein hypoglycosylation is thought to be the main pathogenic factor in CDG-I, the role of truncated DLO intermediates in cellular homeostasis is not clear. Truncated DLO intermediates are known to give rise to cytoplasmic oligosaccharyl phosphates (OSP) by an uncharacterized mechanism. To understand this DLO editing process biochemical and molecular characterization of the activity that generate OSP is needed.RESULTS: I biochemically characterized a DLO diphosphatase (DLODP) that generates OSP and dolichol phosphate from DLO. Subcellular fractionation of mouse liver homogenates demonstrated a microsomal activity that co-distributes with a Golgi apparatus (GA) marker but not with endoplasmic reticulum (ER)-situated dolichol phosphate utilizing enzymes. This unexpected localization of DLODP prompted me to study OSP generation in cells using brefeldin A (BFA), which fuses the GA with the ER. BFA did not affect the levels of truncated DLO or cytoplasmic OSP, present in a cellular model of CDG-I. However, in these, and control cells, BFA caused striking increases of OSP within the endomembrane system. CONCLUSION: the identification of topologically distinct, independently modulated, OSP pools indicates multiple mechanisms for OSP generation and suggest that the GA-situated DLODP may not be the enzyme responsible for OSP generation in CDG-I.