Devenir intracellulaire des vecteurs AAV dans les cellules dendritiques humaines et conséquences sur le transfert de gène

Intracellular fate of AAV particles in human Dendritic Cell and impact on Gene Transfer

• Auteur / Autrice : Axel Rossi
• Direction : Anna Salvetti, Hildegard Büning
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la Vie
• Date : Soutenance le 28/10/2016
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Médecine Moléculaire de Cologne - Centre International de Recherche en Infectiologie (Lyon ; 2013-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École normale supérieure de Lyon (2010-...)
• Jury : Président / Présidente : Mathias Faure
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anna Salvetti, Hildegard Büning, Mathias Faure, Dirk Grimm, Jean Davoust, Sahil Adriouch, Hélène Dutartre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Dirk Grimm, Jean Davoust

Mots clés

Mots clés contrôlés

Techniques de transfert de gènes

Décapsidation virale

Réponse immunitaire

Cellules présentatrices d'antigènes

Tolérance immunitaire

Dependovirus

Mots clés libres

Adeno-associated virus

AAV vector

Transport intracellulaire

Ingénierie de capside

Décapsidation

Tolérance

Réponses Immunitaires

Transfert de gène

Adeno-associated virus

AAV vector

Intracellular trafficking

Capsid Engineering

Uncoating

Tolerance

Immune Responses

Gene Transfer

Résumé

Les vecteurs viraux dérivés du virus adéno-associé (AAV) apparaissent depuis deux décennies, comme des outils efficaces pour le transfert de gène in vivo. Cependant, malgré une faible immunogénicité et une absence de toxicité in vivo, leur optimisation requiert encore un effort important vers une meilleure compréhension de leur biologie et, en particulier, de leur interaction avec le système immunitaire. Au cours de ce travail de thèse, nous avons utilisé une méthode de sélection dirigée in vitro dans le but d’obtenir un variant de capside capable de transduire efficacement un type cellulaire non-permissif aux vecteurs AAV : les cellules dendritiques (DC). En effet, ces cellules jouent un rôle primordial dans l’établissement de la réponse immunitaire et, par conséquent, dans la persistance de l’expression du transgène in vivo. Cette technologie, très répandue dans la communauté AAV, a permis de sélectionner un variant de capside aux propriétés très intéressantes. La mutation sélectionnée, caractérisée in vitro comme induisant une instabilité de la capside, a permis d’identifier et de surmonter un point de blocage majeur dans le processus de transduction des DC par les vecteurs AAV consistant dans l’étape de décapsidation du génome du vecteur dans le noyau cellulaire. De manière intéressante, le variant obtenu exhibe un avantage en terme de transduction non seulement dans les DC mais aussi dans différents modèles de cellules primaires humaines (e.g. HUVEC) ou animales (OBC), peu ou pas permissive à l’AAV. De plus, des expériences de transfert de gène in vivo réalisées dans un modèle murin, indiquent que le variant sélectionné conduit à une meilleure expression du transgène, possiblement due à la mise en place d’un processus de tolérisation. Les propriétés remarquables de ce variant de capside, font de lui un candidat intéressant pour des applications médicales.

Vectors derived from the Adeno-associated virus (AAV) have emerged as an efficient system for in vivo gene transfer. However, despite their low immunogenicity and good tolerance in vivo, a better characterization of the host-AAV interaction is required to be able to fully exploit AAV’s potential fora gene therapy or gene vaccination. In this PhD project, we have used an in vitro directed evolution strategy to select an AAV capsid variant able to transduce human dendritic cell (DC), a non-permissive cell type which plays a critical role in the initiation of immune responses and, consequently, on the persistence of the expression of transgene in vivo. This procedure allowed us to identify an AAV variant characterized by a decreased stability of the capsid in vitro. The use of this mutant as a vector to transduce human DC resulted in an improved uncoating of the vector genome in the cell nucleus, thus identifying this step as major barrier toward DC transduction. Interestingly, the selected variant also displayed an increased transduction efficiency not only in DC but also in different primary human and animal cell types, poorly or non-permissive to AAV. Finally, when injected in mice, this AAV variant resulted in a higher expression of the transgene, associated to a low level of immune responses, suggesting the induction of tolerant state. The remarkable features suggest that our selected variant capsid is a promising candidate for medical applications.