Régulation de l'organisation des microtubules par les adhérences cellulaires au cours de la morphogenèse épithéliale

par Mithila Burute

Thèse de doctorat en Physique pour les sciences du vivant

Sous la direction de Manuel Théry.

Soutenue le 18-05-2016

à Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale physique (Grenoble) , en partenariat avec Laboratoire de physiologie cellulaire végétale (Grenoble) (laboratoire) .

Le président du jury était Corinne Albiges-Rizo.

Le jury était composé de Cayetano González, Joanne Young.

Les rapporteurs étaient Sandrine Étienne-Manneville, Marina Glukhova.


  • Résumé

    Au cours de son développement depuis la cellule unique jusqu’à la forme adulte, l’embryon passe par de nombreuses étapes de morphogenèse. L'harmonie entre les cellules au cours de ces processus est assurée par l’intégration spatiale des signaux externes qui assurent la cohérence des polarités internes et externes des cellules. Ce travail de thèse se concentre sur la façon dont les cellules intègrent les informations spatiales dans la définition de leur polarité au cours de grandes transformations morphologiques comme la transition épithélium-mésenchyme et la dissémination des cellules tumorales. Nous avons utilisé la position du centrosome comme un indicateur de la polarité cellulaire interne en raison de son rôle actif dans l'organisation des microtubules et donc dans l'orientation du transport intra-cellulaire. La polarité corticale a été inférée à partir de la répartition spatiale des adhérences cellule-cellule (ACC) et cellule-matrice (ACM).Dans la première partie, nous avons étudié l'effet de l'amplification du nombre de centrosomes, une caractéristique fréquente dans les cellules tumorales, sur l’adhérence inter-cellulaire. L'amplification des centrosomes dans les cellules de la glande mammaire a conduit à la rupture des adhérences inter-cellulaires ainsi qu’à la genèse de protubérances cellulaire invasive. Cependant le matériel centrosomal étant plus développé, de nombreux microtubules supplémentaires émanait de ces clusters de centrosomes surnuméraires. L'utilisation de modèles cellulaires in vitro et de conditions de culture contrôlées ont révélées que la simple amplification des centrosomes est suffisante pour moduler le destin de cellules transformées et les rendre invasives. Cette étude a révélé que les mécanismes régissant l’orientation la polarité interne des cellules sont liés à l’arrangement spatial de la polarité corticale et que la diaphonie entre les deux perturbe la physiologie du tissu au point d’induire la formation de métastases tumorales.La deuxième partie de l'étude a porté sur l'exploration de la transition épithélium-mésenchyme (EMT). Nous avons étudié le rôle potentiel des mécanismes de régulation de la polarité pour diriger la précision des mouvements cellulaire au cours de l’EMT. Le remodelage des adhérences inter-cellulaires jouant un rôle central au cours de l’EMT, nous avons supposé qu'il était couplé à des changements de polarité interne. Nous avons suivi le positionnement du centrosome dans les cellules épithéliales et dans les cellules dans lesquelles l’EMT était induite par stimulation au TGFb. La libération des cellules mésenchymateuses de leur confinement nous a montré que la séparation des cellules après l’EMT était dépendante de l’inversion de polarité interne dans ces cellules. Ces résultats suggèrent que la dispersion des cellules observée pendant la formation du mésoderme au cours de la gastrulation impliquent un renversement actif et finement contrôlée du couplage entre l’axe de polarité interne et l’asymétrie des deux types d’adhérences cellulaires.Suite à l’étude de ces deux projets impliquant des dispersions cellulaires, nous avons développé un dispositif pour permettre le criblage de médicaments contre les dérèglements cellulaires impliqués dans la formation des métastases. Nous avons à nouveau utilisé un modèle simplifié de paires de cellules sur des micropattern pour détecter la capacité de dispersion des cellules suite à des stimulations externes comme celle induisant l’EMT. Le test, qui permet de mesurer le degré de séparation des cellules à l’aide d’une seule image, a été validé sur quatre lignées de cellules épithéliales différentes. Le dispositif final a été adapté à un format de plaque 96 puits en collaboration avec l’entreprise Cytoo afin de permettre des criblages à haut contenu. Ce kit a ensuite été validé en testant des médicaments connus contre l’EMT.

  • Titre traduit

    Interplay between microtubule organization and cell adhesions during epithelial morphogenesis


  • Résumé

    Development from single cell embryo to multicellular adult form of organism involves tremendous morphogenesis. The well defined and highly controlled morphonogenetic processes are crucial at every stage of development including gastrulation, organogensis, wound healing and tissue maintenance. The necessary harmony between cells for these processes is achieved by integration of internal and external polarity cues. This thesis work is focused on understanding how cells integrate polarity cues to drive morphogenetic event such as of Epithelial to mesenchymal transition (EMT) and cancer metastasis. We used centrosome position as an indicator of internal cell polarity due to its active role in organization of microtubules and orientation of internal traffic of endocytosed and secreted proteins; while cortical polarity was inferred by polarized distribution of cell-cell adhesions (CCA) and cell-matrix adhesions (CMA). In the first part, we studied effect of centrosome amplification, which is very common in human cancer; on CCA. Inducible centrosome amplification in mammary gland cells led to destabilization of CCA alongwith generation of invasive cell protrusions. Using a minimal model of tissue; confined on micropatterns, we demonstrated that cells with amplified centrosome correctly oriented their internal polarity axis like normal cells although increased centrosomal protein and peri-centriolar material emanated higher centrosomal microtubules. Use of in vitro models of cell lines and controlled culture conditions revealed that mere amplification of centrosome was sufficient to drive cell fate for cancer-like events in the absence of any additional external growth signals capable of affecting cortical polarity. This study revealed that internal polarity cues interact with cortical polarity signals and the crosstalk between the two governs the physiological state of the cell during transformation events like cancer metastasis. The second part of the study focused on exploring how internal polarity during EMT is modulated to drive precise spatial movements during development. Cell adhesion remodelling being central to EMT, we hypothesized that it was coupled to internal polarity changes. We monitored centrosome position in epithelial and in cells induced for EMT by TGFb and found that nucleus-centrosome axis was reversed. This phenomenon of polarity reversal strongly suggested that internal polarity cues and positioning of organelles is coupled to signals that polarize CCA and CMA distribution. A shift in the force balance between CCA and CMA was observed upon EMT and suggested that CMA forces dominated in mesenchymal cells and release of cells from confinement clearly revealed that ability of cell separation was dependent upon their internal polarity. These results demonstrated that scattering events observed during mesoderm formation during gastrulation or metastasis events in cancer involve active and tightly controlled reversal of internal polarity axis coupled to cortical polarity of cells. From the understanding of above two projects involving cancer-like scattering phenomenon, we developed a product to allow robust drug screening against cancer drugs. We once again used simplified two-cell model on micropattern geometries to develop an assay to detect scattering ability of cells after events like EMT. The assay was validated by EMT transformation of 4 different epithelial cells lines and detection of their scattering ability by single time point picture assay. We used internuclear distance between the cell-pair as the main parameter for scoring the scattering index of cells with possibility of automated image processing. The final product was manufactured in 96-well plate format by industrial collaborator Cytoo for high content screening. Preliminary validation using drugs against EMT constituted proof of principle for the product.


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