Recherche des substrats et des activateurs d'une nouvelle famille de protéine kinase bactérienne

Search for substrates and activators of a new family of bacterial protein kinases

• Auteur / Autrice : Takla El khoury
• Direction : Jean-Michel Jault, Jihad Attieh
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 29/02/2016
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE) en cotutelle avec Université de Balamand (Tripoli, Liban)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Franck Fieschi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mirna Chahine, Christophe Grangeasse
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Galinier, Richard Maroun

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bacillus subtilis

Phospholipides

Protéines kinases

Mots clés libres

YdiB

Protéine kinase

Bacillus subtilis

Phospholipides

Stress oxydant

YdiB

Protein kinase

Bacillus subtilis

Phospholipids

Oxidative stress

Résumé

Les protéines kinases sont responsables de la phosphorylation des protéines, une modification post-traductionnelle qui contrôle ainsi de manière très efficace et presque instantanée une multitude de processus cellulaires. Elles sont impliquées dans la régulation des voies métaboliques dans les organismes permettant leurs adaptations aux changements environnementaux. Chez les procaryotes, l'existence de sérine/thréonine et tyrosine kinases est resté pendant longtemps un sujet de controverse. Cependant, au cours des deux dernières décennies, de nombreuses études ont montré que ces types de phosphorylation (Ser/Thr/Tyr) existent chez les bactéries et sont impliqués dans la régulation d'une grande variété de processus biologiques. En plus de protéines kinases apparentés à des enzymes eucaryotes, les bactéries ont également des protéines kinases spécifiques n’ayant aucune ressemblance structurale avec des protéines eucaryotes ce qui, lorsqu’elles sont essentielles, les qualifient en tant que cible pour de nouveaux agents antimicrobiens. YdiB est une nouvelle protéine kinase bactérienne de Bacillus subtilis. La localisation d’YdiB a été étudiée par immunofluorescence révélant sa présence à proximité de la membrane plasmique. L'interaction d’YdiB avec les phospholipides a été étudiée par des essais de flottation et résonance plasmonique de surface. Ceci révèle la présence d'une interaction stable et forte entre la kinase et deux phospholipides: la phosphatidylsérine et la phosphatidyléthanolamine. En outre, la constante d'affinité (KD) entre YdiB et la phosphatidylsérine a été identifiée et est de l’ordre de 13.3x10-9 M. De plus, ces deux phospholipides, ainsi que leur têtes polaires, sont capables d'induire de manière significative l'autophosphorylation d’YdiB.Par ailleurs, le rôle d’YdiB dans la croissance bactérienne en particulier lors d’un stress oxydant a également été étudié dans la souche sauvage et dans le mutant ∆ydiB. Dans des conditions de stress oxydant, la souche ∆ydiB est incapable de survivre alors qu’une complémentation conditionnelle de ce mutant a permis de restaurer un profil de croissance normale de la bactérie. Cela révèle le rôle important joué par YdiB dans la résistance bactérienne au stress oxydant. En outre, des protéines impliquées dans la résistance au stress oxydant comme la superoxide dismutase F (SodF) et superoxide dismutase A (SodA) ont été testés comme substrats potentiels pour YdiB. Par des tests de trans-phosphorylation, nous avons pu montrer que SodA pourrait être un substrat potentiel pour YdiB expliquant ainsi son implication dans la résistance au stress oxydatif dans Bacillus subtilis.

Protein kinases are responsible of protein phosphorylation, a post-translational modification and a very effective and almost instantaneous control of a multitude of cellular processes. They are involved in the regulation of metabolic pathways in living organisms enabling their adaptation to environmental changes. In prokaryotes, the existence of serine/threonine and tyrosine kinases was, for a long time, a subject of controversy. However, over the past two decades, many studies have shown that these types of phosphorylation (Ser/Thr/Tyr) do exist in bacteria and are involved in the regulation of a wide variety of biological processes. In addition to protein kinases related to eukaryotic enzymes, bacteria also have some specific protein kinases having no structural resemblance to their eukaryotic homologues which, if essential, made them a possible target for new antimicrobial agents. YdiB is a novel bacterial protein kinase from Bacillus subtilis. In situ localisation of YdiB has been studied by immunofluorescence which reveals its presence near the plasma membrane. The interaction of YdiB with the membrane phospholipids was assessed by flotation assay and surface plasmon resonance demonstrating the presence of a stable and strong interaction between the kinase and two phospholipids: phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine. In addition, the affinity constant (KD) between YdiB and phosphatidylserine was found to be equal to 13.3 x 10-9 M. Moreover, these two phospholipids or just their charged headgroups were able to significantly induce the autophosphorylation of YdiB.On the other hand, the role of YdiB in the bacterial growth especially under oxidative stress was also studied in the wild-type strain and in ∆ydiB mutant. Under oxidative stress conditions, the deleted strain was unable to survive whereas a conditional complementation of ∆ydiB mutant was able to restore a normal growth profile for the bacterium. This reveals the important role played by YdiB in the bacterial resistance to oxidative stress. In addition, protein involved in the resistance to oxidative stress like Superoxide dismutase F (SodF) and superoxide dismutase A (Sod A) were tested as potential substrates for YdiB. Doing the trans-phosphorylation assay, we were able to prove that Sod B could be a potential substrate for YdiB thus explaining its involvement in the resistance to oxidative stress in Bacillus subtilis.