Le rôle des ARN non codants dans le contrôle de processus liés à la pathogenèse chez Clostridium difficile

par Pierre Boudry

Thèse de doctorat en Microbiologie Procaryote et Eucaryote

Sous la direction de Olga Soutourina.

Soutenue en 2015

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019) (autre partenaire) .

mots clés

• Sporulation
• Clostridium difficile -- génétique
• Protéine IHF-1
• Petit ARN non traduit
• Protéines associées aux CRISPR
• Bactériophages -- génétique
• Régulation de l'expression des gènes bactériens

Résumé

Clostridium difficile est la cause la plus fréquente de diarrhée nosocomiale dans le monde. Nos précédentes données suggèrent fortement l'importance des mécanismes basés sur les ARN pour la modulation de l'expression de gènes. Afin de comprendre la fonction de la protéine chaperonne d'ARN Hfq, nous avons construit et caractérisé une souche déplétée pour Hfq. Conformément aux phénotypes observés, l'analyse transcriptomique révèle des effets pléiotropiques lors de la déplétion de Hfq sur l'expression des gènes, parmi lesquels des gènes codant pour des protéines impliquées dans la sporulation, la réponse au stress, des protéines de parois et des régulateurs transcriptionnels. Un grand nombre de gènes appartenant au régulon SigK, un facteur a spécifique de la sporulation, sont surexprimés lors de la déplétion de Hfq. RCd1 est un ARN régulateur liant Hfq avec une haute affinité in vitro et in vivo. Nos résultats suggèrent que RCd1 contrôle l'expression de SigK par inhibition de l'excision de l'élément skie', un prophage cryptique inséré dans le gène sigK. Cet entéropathogène est exposé à de multiples éléments génétiques exogènes au sein du microbiote intestinal. Les systèmes CRISPR-Cas basé sur des ARN non codant, permettent aux bactéries de s'adapter aux éléments génétiques étrangers. Nos données révèlent l'expression et la maturation des ARN CRISPR fournis par les différents loci. Grâce à des expériences de conjugaison de plasmide et des expériences de transformation chez un hôte hétérologue, Escherichia coli, nous avons démontré une interférence active des systèmes CRISPR-Cas. Ainsi, cette thèse met en évidence la caractérisation et l'identification de mécanismes médié par ARN non-codant chez cet entéropathogène.

Titre traduit

Role of the non-coding RNA in the control of pathogenesis associated processes in Clostridium difficile

Résumé

Clostridium difficile is the cause of most frequently occurring nosocomial diarrhea worldwide. Our previously data strongly suggest the importance of RNA-based mechanisms for the control of gene expression in C. Difficile. In an effort to understand the function of the RNA chaperone protein Hfq, we constructed and characterized an Hfq-depleted strain. In accordance with observed phenotypes, the transcriptome analysis revealed pleiotropic effects of Hfq depletion on gene expression, including genes encoding proteins involved in sporulation, stress response, metabolic pathways, cell wall-associated proteins, transporters, and transcriptional regulators. Remarkably, a great number of genes of the regulon dependent on sporulation-specific sigma factor, SigK, were upregulated in the Hfq¬depleted strain. We found a regulatory RNA, named RCd1, binding Hfq with a high affinity in vitro and in vivo. Our results suggest that RCd1 control SigK expression by the inhibition of skie element excision, a sigk disrupting cryptic prophage. As an enteropathogen, C. Difficile must be exposed to multiple exogenous genetic elements in bacteriophage-rich gut communities. CRISPR-Cas systems based on non-coding RNA, allow bacteria to adapt to foreign genetic invaders. Our data revealed active expression and processing of CRISPR RNAs from multiple type I-B CRISPR arrays. Through plasmid conjugation experiments and plasmid transformation experiments in a heterologous host, Escherichia coli, we demonstrate a defensive function of the CRISPR-Cas system. Altogether, this thesis provides characterization and identification of non-coding RNA—based mechanisms in this emergent enteropathogen.