Rôle de l’oncogène ALK muté dans l’oncogenèse du neuroblastome et le développement

Role of the mutated ALK oncogene in neuroblastoma oncogenesis and in development

• Auteur / Autrice : Lucille Delisle
• Direction : Isabelle Janoueix-Lerosey
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 09/07/2015
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer, Hétérogénéité, Instabilité et Plasticité
• Jury : Président / Présidente : Gilles Vassal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Janoueix-Lerosey, Gilles Vassal, Yvan, de Launoit, Stanislas Lyonnet, Evelyne Bloch-Gallego, Hermann Rohrer, Michel Peuchmaur, Olivier Delattre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Yvan, de Launoit, Stanislas Lyonnet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Souris transgéniques

Neuroblastome

Mots clés libres

Neuroblastome

ALK

Développement

RET

Modèle murin

Neuroblastoma

ALK

Developement

RET

Mouse model

Résumé

Le neuroblastome (NB) est une tumeur pédiatrique du système nerveux sympathique. Des mutations activatrices du gène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) ont été identifiées dans 8 % des formes sporadiques et dans des formes familiales de NB. Le gène ALK code pour un récepteur tyrosine kinase appartenant à la famille des récepteurs à l’insuline, principalement exprimé dans le système nerveux central et périphérique. Le récepteur ALK représente une cible thérapeutique pertinente dans ce cancer. Des mutations de novo du gène ALK ont également été rapportées dans une forme syndromique associant NB congénital et encéphalopathie sévère avec dysmorphie du tronc cérébral, suggérant un rôle développemental du gène ALK en plus de son implication dans l’oncogenèse.Dans ce contexte, mon projet de thèse avait pour but de déterminer le rôle du récepteur ALK muté dans l’oncogenèse du NB et le développement, principalement à l’aide de modèles murins originaux obtenus au laboratoire. J’ai ainsi largement caractérisé deux lignées de souris KI (Knock-In) Alk pour les deux mutations les plus fréquemment observées dans le NB: F1174L et R1275Q chez l’homme, correspondant à F1178L et R1279Q chez la souris.Une analyse détaillée de ces deux lignées de souris n’a pas révélé de phénotype majeur chez les souris KI AlkR1279Q hétérozygotes et homozygotes ainsi que chez les hétérozygotes KI AlkF1178L. Par contre, nous avons documenté une forte létalité post-natale des animaux KI AlkF1178L homozygotes et montré que ces nouveaux-nés présentent des troubles majeurs d’alimentation. Les homozygotes KI AlkF1178L phénocopient donc partiellement les patients encéphalopathes. La différence d’effet observé entre les animaux hétérozygotes et homozygotes suggère fortement qu’il existe un seuil d’activation du récepteur Alk compatible avec la survie.Nous avons ensuite exploré le rôle du récepteur ALK muté dans le système nerveux sympathique des souris KI Alkmut. Cette analyse a montré que l’activation du récepteur induit un excès de prolifération des neurones sympathiques de E14.5 à la naissance. Néanmoins, nous n’avons pas observé de NB chez ces animaux. En croisant ces souris avec la lignée TH-MYCN, nous avons documenté une coopération des mutations Alk avec l’oncogène MYCN pour le développement de NB. La comparaison des profils transcriptomiques des tumeurs murines MYCN et MYCN/Alkmut a révélé que l’expression de l’oncogène Ret (codant également un récepteur à activité tyrosine kinase) était fortement induite par l’activation du récepteur Alk. Le traitement des souris par un inhibiteur de l’activité kinase du récepteur Ret a montré une diminution de la taille des tumeurs suggérant que le gène Ret joue un rôle majeur dans l’oncogenèse induite par le récepteur Alk muté. Par ailleurs, l’induction de l’expression du gène RET par le récepteur ALK muté dans les NB a été confirmée dans des lignées et des tumeurs humaines.Afin de déterminer le mécanisme par lequel l’activation du récepteur ALK aboutit à la régulation de l’expression du gène RET des expériences ont été effectuées sur des lignées humaines de NB dans lesquelles le récepteur ALK peut être activé ou inactivé. Ce travail a montré que l’expression du gène RET est dépendante de l’axe ALK-ERK-ETV5. En effet, la modulation de l’activité du récepteur ALK affecte l’expression des gènes ETV5 et RET. Cet effet est dépendant de l’activation de la voie MEK/ERK. Par ailleurs, ETV5 active l’expression du gène RET. Afin de confirmer le rôle de Ret dans l’oncogenèse dépendante du récepteur Alk, nous avons croisé des souris portant une mutation activatrice de Ret avec les souris TH-MYCN. Nous avons ainsi mis en évidence que le récepteur Ret activé coopère avec l’oncogène MYCN dans le développement de tumeurs et que ces tumeurs sont des NB présentant des caractéristiques très semblables à celles des tumeurs MYCN/Alkmut. Le gène Ret apparaît donc comme une cible essentielle du récepteur Alk muté dans l’oncogenèse du NB.

Neuroblastoma (NB) is a pediatric tumor arising from the sympathetic nervous system. Activating mutations of the ALK gene have been observed in around 8 % of sporadic neuroblastoma as well as in familial cases. The ALK gene encodes a tyrosine kinase receptor of the insulin receptor super-family. It is mainly expressed in the central and peripheral nervous system. The ALK receptor represents a therapeutic target in this cancer. De novo ALK mutations have also been reported in a syndrome associating congenital NB and severe encephalopathy with abnormal shape of the brainstem, suggesting a developmental role for the ALK gene in addition to its implication in oncogenesis.In this context, my PhD project was to determine the role of the mutated ALK receptor in NB oncogenesis and in development, mainly with original mouse models obtained in the laboratory. I extensively characterized two knock-in (KI) Alk mouse lines with the two mutations that are most frequently observed in NB: F1174L and R1275Q in human and F1178L and R1279Q in mouse.A detailed analysis of these two mouse lines showed that the KI AlkR179Q heterozygous and homozygous mice as well as the KI AlkF1178L heterozygous mice do not show striking clinical signs. On the contrary, we documented a high postnatal lethality for KI AlkF1178L homozygous mice and showed that these pups presented with a dramatic reduced milk intake. Thus, the KI AlkF1178L homozygous mice partially phenocopy the human patients with encephalopathy. The difference of phenotype between the heterozygous and the homozygous KI AlkF1178L mice highly suggest a threshold of activity of the Alk receptor compatible with survival.We then explored the role of the mutated ALK receptor in the sympathetic nervous system of the KI Alkmut mice. This analysis showed that the activation of the receptor induces an excess of proliferation in sympathetic neurons from E14.5 to birth. However, we could not observe NB in these animals. We next bread these mice with the transgenic TH-MYCN line. We documented cooperation between Alk mutations and the MYCN oncogene to induce NB. Comparison of transcriptomic profiles of MYCN vs MYCN/Alkmut tumors revealed that the expression of the Ret oncogene (encoding a tyrosine kinase receptor) was strongly induced by the activation of the Alk receptor. Besides, the induction of the expression of the RET gene by the mutated ALK receptor in NB was confirmed in human cell lines and tumors.In order to determine the mechanism by which the activation of the ALK receptor regulates RET gene expression, experiments were done on human NB cell lines in which the ALK receptor can be activated or inactivated. This work showed that RET gene expression is dependent of the ALK-ERK-ETV5 axis. Indeed, the modulation of the ALK receptor activity affects gene expression of ETV5 and RET. This effect is dependent of the activation of the MEK/ERK pathway. Besides, ETV5 increases RET gene expression. In order to confirm the role of the Ret receptor in oncogenesis driven by the mutated Alk receptor, we bread mice bearing an activating mutation of the Ret gene with the TH-MYCN mice. We showed that the activated Ret receptor cooperates with the MYCN oncogene in tumor formation and that these tumors are NB presenting with characteristics very close to MYCN/Alkmut tumors. Thus, the Ret gene appears to be an essential target of the mutated Alk receptor in NB oncogenesis.