Insights into Atoh1 Phosphorylation in Cerebellum Development and Medulloblastoma Formation

par Laure Bihannic

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Olivier Ayrault.

  • Titre traduit

    Rôle de la phosphorylation du facteur de transcription Atoh1 dans le développement du cervelet et dans le médulloblastome


  • Résumé

    Le médulloblastome est la plus fréquente des tumeurs pédiatriques malignes du cerveau et est divisé en quatre sous-groupes moléculaires. Le groupe Sonic Hedgehog (SHH), caractérisé par l’activation de la voie SHH, présente une surexpression du facteur de transcription basique hélice-boucle-hélice Atoh1. Atoh1 est essentiel pour le développement du cervelet et plus spécifiquement pour la formation des précurseurs des cellules granulaires, qui sont aussi la cellule d’origine du médulloblastome SHH. Dans le médulloblastome SHH, Atoh1 agit comme un facteur pro-tumoral en collaboration avec la voie SHH. De plus, l’inhibition des niveaux protéiques d’Atoh1 inhibe la prolifération tumorale in vitro et in vivo. Etant donnée l’importance de la protéine Atoh1 dans la formation du médulloblastome SHH, Atoh1 pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour traiter le médulloblastome SHH. Cependant, les mécanismes de régulation d’Atoh1 sont encore mal connus.Les modifications post-traductionnelles sont connues pour réguler les niveaux protéiques dans les cellules. Plusieurs types de modifications régulent la dégradation protéique et elles incluent l’ubiquitination et la phosphorylation. Nous avons décidé de nous concentrer dans un premier temps sur le rôle potentiel de la phosphorylation d’Atoh1 sur sa fonction et régulation durant le développement du cervelet et la formation de médulloblastome.Par une analyse de spectrométrie de masse, nous avons identifié douze sites de phosphorylation sur la protéine Atoh1. Parmi ces douze sites, seulement deux, la sérine 328 (S328) et la sérine 339 (S339), sont importantes pour la stabilité et la fonction de la protéine. En effet, les deux mutants de phosphorylation spécifiques de ces deux sites, Atoh1-S328A et Atoh1-S339A, ont une demi-vie plus longue ainsi qu’une activité transcriptionnelle augmentée dans les précurseurs des cellules granulaires par rapport à la forme sauvage d’Atoh1. Nous avons ensuite réalisé une purification d’affinité en tandem différentielle suivie par une analyse par la technologie d’identification protéique multidimensionnelle (MudPIT) pour définir les partenaires phospho-spécifiques d’Atoh1. Nous avons découvert que l’ubiquitine ligase E3 Huwe1 est responsable de la dégradation d’Atoh1 de manière phospho-dépendante dans les progéniteurs des cellules granulaires. Nous avons aussi montré que SHH protège Atoh1 de la dégradation médiée par Huwe1 par l’intermédiaire des phosphatases de la famille des PP2A. De manière importante, ce mécanisme de régulation d’Atoh1 est nécessaire au bon développement du cervelet. De plus, dans le contexte tumoral, un faible niveau d’ARNm d’HUWE1 est associé à une mauvaise survie chez les patients ayant un medulloblastome SHH.Au vu de ces résultats, nous souhaitons étudier plus en détail le rôle de la phosphorylation d’Atoh1 ainsi que la contribution de ce nouveau mécanisme dans le médulloblastome. Nous souhaiterions ainsi exploiter nos résultats pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le médulloblastome SHH.


  • Résumé

    Medulloblastoma (MB) is the most common pediatric malignant brain tumor and is divided in four subgroups by gene profiling. The well-known subgroup harboring an activation of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway shows an upregulation of the proneural basic helix-loop-helix transcription factor Atoh1. Atoh1 is essential for cerebellum development and more specifically for the formation of the granule neuronal progenitors (GNPs), which are the cells of origin of SHH induced MB. In tumoral context, Atoh1 acts as a pro-tumor factor in cooperation with SHH pathway. In addition, the inhibition of Atoh1 protein level prevents MB proliferation in vitro and in vivo. Thus, given the strong implication of Atoh1 protein in MB formation, Atoh1 seems to be a potential therapeutic target to treat SHH MB. However, up to date, mechanisms underlying its regulation remain to be elucidated. Posttranslational modifications are known to regulate protein levels in cells. Several modifications regulate protein turnover including the two most prominent, ubiquitination and phosphorylation. We decided to focus primarily our study on a potential role of Atoh1’s phosphorylation on its function and regulation both during cerebellar development and MB genesis. Using mass spectrometry analysis, we identified twelve phosphorylation sites on Atoh1 protein. Among them, only two, the serine 328 (S328) and serine 339 (S339), were critical for Atoh1 stability and function. The two single phospho-deficient mutants, Atoh1-S328A and Atoh1-S339A, displayed a longer half-life and increased transcriptional activity in granule neuron progenitors when compared to the wild-type form of Atoh1. Next, we employed differential tandem affinity purification followed by Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) analysis to define Atoh1 phospho-specific partners. We uncovered that the E3 ubiquitin ligase Huwe1 is responsible for Atoh1 degradation in a phospho-dependent manner in granule neuron progenitors. We also discovered that SHH protects Atoh1 against its degradation mediated by Huwe1 through the phosphatases of PP2A family. Importantly, this machinery is required for proper cerebellar development and we highlighted that low levels of HUWE1 are associated with a poor prognosis in patient harboring a SHH medulloblastoma.Given this data, we wish to dissect the role of Atoh1 phosphorylation, and the contribution of this new pathway in MB. We anticipate exploiting our findings to develop new therapeutic strategies in SHH MB.

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