Mécanisme d’action d’une classe d’antibiotiques depuis leur entrée jusqu’à leur cible chez la bactérie : visualisation en temps réel

Mechanism of action of a class of antibiotics from their entry to their target in bacteria : a real time visualization

• Auteur / Autrice : Maho Okuda
• Direction : Satoko Yoshizawa, Dominique Fourmy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 30/09/2015
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Gènes, Génomes, Cellules (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Luc Pernodet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Satoko Yoshizawa, Dominique Fourmy, Jean-Luc Pernodet, Carine Tisné, Gilles Truan, Mathias Springer
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Carine Tisné, Gilles Truan

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie à super-résolution

Néomycines

Ribosomes

Traduction génétique

Microscopie de fluorescence

Mots clés libres

Microscopie de fluorescence

Microscopie super-résolutive

Traduction

Ribosome

Aminoglycosides

Aptamère Spinach

Fluorescence microscopy

Super-resolution microscopy

Translation

Ribosome

Aminoglycosides

Spinach aptamer

Résumé

Des techniques variées de visualisation de molécules d’intérêt sur cellules vivantes ou fixées ont permis de suivre leur synthèse, localisation, dégradation et autres activités. Dans cette étude, nous avons développé deux outils de fluorescence pour étudier la synthèse des protéines sur bactéries vivantes. Le premier décrit l’utilisation du système Spinach pour l’imagerie du ribosome. Cette approche diffère des méthodes conventionnelles qui utilisent des protéines fluorescentes puisque l’ARN ribosomal 16S contient un aptamère qui rend fluorescent un composé fluorogène. Une étude comparative de la performance de différents aptamères Spinach a été réalisée. Un deuxième outil se focalise sur l’accumulation d’un antibiotique de la famille des aminoglycosides (ligand du ribosome) conjugué à un fluorophore. Ce nouveau conjugué, qui a conservé son activité bactéricide permet pour la première fois de visualiser l’accumulation de l’antibiotique sur bactérie vivante. Cela permet une analyse au niveau de la cellule unique d’une population bactérienne exposée à l’antibiotique. Nous avons également obtenu des données sur la localisation de l’antibiotique une fois qu’il a pénétré dans la bactérie à une résolution inégalée par microscopie super-résolutive. Nous espérons que ces deux méthodes vont maintenant permettre une meilleure compréhension de la synthèse des protéines et fournir une vue nouvelle de la pénétration des antibiotiques dans les bactéries pour y produire leur action bactéricide.

Various visualizing techniques have previously enabled monitoring the fate of molecules of interest: their expression, localization, degradation and other activities in live or fixed cells. In this study, we have developed two fluorescent tools to study protein synthesis in live bacterial cell. The first one describes the application of Spinach system to ribosomes imaging. This is different from conventional methods (that use fluorescent proteins) in that 16S rRNA contains an inserted RNA aptamer that elicits fluorescence of a fluorogenic compound. A comparative study of the performance of different Spinach aptamers was performed here. A second system focuses on the uptake of a fluorescently labeled ligand of the ribosome, an antibiotic of the class of aminoglycosides. This novel conjugate, which kept its bactericidal activity allows for the first time imaging of aminoglycoside uptake on live bacteria. This opened the door to a single cell analysis of bacterial cell populations. We also obtained data about the localization of the antibiotic once inside the bacteria to an unprecedented resolution using super resolution microscopy. We hope that both of these methods will contribute to a better understanding of protein synthesis as well as provide a novel view on the way antibiotics penetrate into cells and perform their bactericidal action.