Discriminations cinétiques pour l'analyse sélective en mélanges complexes : applications en imagerie

Kinetic discriminations for selective analysis in complex mixtures : applications in imaging

• Auteur / Autrice : Jérôme Querard
• Direction : Ludovic Jullien, Thomas Le Saux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie-Physique
• Date : Soutenance le 12/06/2015
• Etablissement(s) : Paris 6
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Processus d'activation sélectif par transfert d'énergie uni-électronique ou radiatif (Paris ; 1998-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Dieter Braun, Andrey Klymchenko, Emmanuel Maisonhaute, Arnaud Gautier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Emmanuel Beaurepaire, Dominique Davous

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectroscopie de fluorescence

Biochimie physique

Mots clés libres

Méthodes analytiques

Dosage sous contrôle cinétique

Sondes photochromes

Modulation lumineuse

Détection en quadrature de phase

Imagerie sélective en fluorescence

Quadrature detection

Light modulation

Résumé

Les milieux biologiques sont des mélanges chimiques d'un intérêt exceptionnel. Leur étude nécessite la conception d'outils analytiques respectant les caractéristiques singulières et contraignantes de ces milieux. Nous avons développé un protocole d'imagerie non-invasif permettant de détecter sélectivement et de quantifier une espèce cible dans un mélange complexe telle qu'une cellule vivante. Notre approche exploite la réponse au premier ordre en quadrature de phase d'une sonde photochrome soumise à une modulation lumineuse périodique. Un cadre théorique complet nous a permis d'identifier les conditions d'illumination qui maximisent cette réponse en ajustant les deux paramètres de contrôle, l'intensité lumineuse moyenne et la fréquence angulaire de l'excitation lumineuse modulée, de sorte à satisfaire des conditions de résonance robustes. La contribution spécifique de la sonde photochrome ciblée au sein d'un mélange de composés interférents (photochromes ou non) est sélectivement extraite du signal global grâce à une détection en quadrature de phase. Après une validation in vitro, ce protocole a été appliqué en microscopie de fluorescence pour l'imagerie sélective dans des cellules de mammifères et des poissons zèbres. Cette approche ouvre des perspectives pour l'observation multiplexée dans des échantillons biologiques. Des améliorations ont été apportées au protocole original afin d'atteindre une résolution temporelle suffisante pour la plupart des études dynamiques en biologie.

Biological media are chemical mixtures of exceptional interest. Their investigation requires conceiving analytical tools fulfilling the singular and demanding features of these media. We have designed a non-invasive imaging protocol allowing to selectively detect and quantify a given target in a complex mixture such as a living cell. Our approach relies on the first order out-of-phase response of a targeted photoswitchable probe to periodic light modulation. An extensive theoretical framework enabled us to identify the illumination conditions that maximize this response by appropriately tuning the two control parameters, the average light intensity and the radial frequency of the modulated light excitation, so as to satisfy robust resonance conditions. The specific contribution of the targeted probe within a mixture of interfering species (photoswitchable or not) is selectively retrieved from the overall signal thanks to quadrature detection. After in vitro validation, this protocol was applied in optical fluorescence microscopy for selective imaging in mammalian cells and zebrafish. This approach opens attractive perspectives for multiplexed observations in biological samples. Further refinements allowed to reach a temporal resolution relevant for most dynamic studies in biology.