Expression de type sauvage et des variantes de l’Apolipoprotéine A-I humaine chez Pichia pastoris

Expression of wild type and variants of human apolipoprotein A-I in Pichia pastoris

• Auteur / Autrice : Vignesh Narasimhan Janakiraman
• Direction : Xavier-François Santarelli, Krishnan Venkataraman
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie-Immunologie
• Date : Soutenance le 11/12/2015
• Etablissement(s) : Bordeaux en cotutelle avec Vellore Institute of Technology (Vellore, Inde)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biotechnologie des Protéines Recombinantes à Visée Santé (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Guhan Jayaraman
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Guhan Jayaraman, Frédéric de Lamotte-Guéry

Mots clés

Mots clés contrôlés

Apolipoprotéine A-I

Pichia

Mots clés libres

Apolipoprotéine a-I (ApoA1)

Pichia pastoris

ApoA1-Milano et ApoA1- Paris

Chromatographie par mode-mixte

HEA HyperCel

PPA HyperCel

Capto MMC

Apolipoprotein a-I (ApoA1)

Pichia pastoris

ApoA1-Milano and ApoA1- Paris

Mixed-mode chromatorgraphy

HEA HyperCel

PPA HyperCel

Capto MMC

Résumé

Les lipoprotéines de haute densité (High Density Lipoprotein, HDL) permet deréduction de risque de maladies cardio-vasculaires principalement en raison de leurcapacité à éliminer le cholestérol accumulé des artères (via transport inverse ducholestérol). Les effets protecteurs des HDL sont médiés par l'apolipoprotéine AI(ApoA1), qui est le La protéine la plus importante quantitativement du HDL. L’ApoA1favorise l'efflux de cholestérol vers le foie pour l'excrétion. Une augmentation desniveaux plasmatiques de l’ApoA1 est généralement acceptée d'êtrecardioprotecteur, ce qui en fait un potentiel thérapeutique. Deux variantes naturelle(mutants) de l’ApoA1, Milano et Paris, sont caractérisées par une mutationponctuelle unique a permis l'introduction d'un résidu cystéine. Populations avecApoA1-Milano ont été rapportés d'avoir un système cardiovasculaire, même avec defaibles niveaux de plasma de ApoA1 et HDL. Il est donc d'intérêt pour générerrecombinante de type sauvage et des variantes de ApoA1 humaine pour desapplications thérapeutiques potentielles. Dans cette étude, de type sauvagerhApoA1 a été produit chez P. pastoris et purifié par chromatographie en modemixte en une seule étape. Par la suite, un processus intégré a été le développementde la production et la récupération rapide de type sauvage rhApoA1 chez P. pastorispar chromatographie par lit expansée. En outre, les variantes de l'ApoA1, Milano &Paris, ont été générées par mutagenèse dirigée et ont été exprimés chez P. pastoris.Les motifs d’adsorption de rhApoA1-Milano et rhApoA1-Paris ont été comparés àcelle de type sauvage ApoA1 et les différences ont été discutées.

The high-density lipoprotein (HDL) complex helps reduce the risk of cardiovasculardisorders mainly due to its ability to remove accumulated cholesterol from arteriesvia reverse cholesterol transport. These protective effects of HDL are known to bemediated by Apolipoprotein A-I (ApoA1), which is the major protein component ofHDL. ApoA1 is a lipid binding protein and promotes cholesterol efflux fromperipheral tissues to the liver for excretion. An increase in the plasma levels ofApoA1 is generally accepted to be cardioprotective, making it a potentialtherapeutic. Two naturally occuring variants of ApoA1, namely the Milano & Parismutants, are characterised by a single point mutation resulting in the introduction ofa Cysteine residue. Populations with ApoA1-Milano have been reported to have ahealthier cardiovascular system even with low plasma levels of ApoA1/HDL. It ishence of interest to generate recombinant wild type and variants of human ApoA1for potential therapeutic applications. In this study, wild type rhApoA1 was producedin P. pastoris and purified by mixed-mode chromatgraphy in a single step.Subsequently, an integrated process has been development for the production andrapid recovery of wild type rhApoA1 in Pichia pastoris. This has paved way to theestablishment of a scalable integrated process that could be further developed toindustrial levels. In addition, the cysteine variants of ApoA1, Milano & Paris, havebeen generated by site directed mutagenesis and have been successfully expressedin P. pastoris. The binding patterns of rhApoA1-Milano and rhApoA1-Paris have beencompared with that of wild-type ApoA1 and the differences have been discussed.