Une approche de génétique classique pour l' isolement et la caractérisation de mutants affectés dans la remobilisation des lipides chez Chlamydomonas reinhardtii

A forward genetic approach toward isolation and characterization of mutants defected in oil remobilization in Chlamydomonas reinhardtii

• Auteur / Autrice : Caroline Cagnon
• Direction : Gilles Peltier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 02/04/2015
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Frederic Carriere
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ben Field
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fayza Daboussi, Thierry Chardot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microorganismes -- Métabolisme

Biocarburants

Microalgues

Mots clés libres

Triacylglycérols

Amidon

Microalgues

Biocarburants

Mutants

Criblage

Métabolisme

Triacylglycerols

Starch

Microalgae

Biofuels

Mutants

Screening

Metabolism

Résumé

Les microalgues accumulent de grandes quantités d’huile, et sont de bons candidats pour la production de biocarburants. Mais des verrous techniques et biologiques doivent être levés pour une production rentable. Augmenter la teneur en huile par cellule et découvrir des protéine clés du métabolisme des triglycérides sont des objectifs importants. Nous avons mis en place une approche de génétique classique ciblée sur l’isolement de mutants d’insertion affectés dans la remobilisation des lipides de réserves suite à la re-supplémentation en azote après carence. Nous avons mis au point un protocole de criblage à haut débit basé sur la semi-quantification de ces lipides qui nous a permis d’isoler plus de 30 mutants. Nous avons identifié les loci d’insertion pour certains en utilisant la méthode Genome Walker. Le marqueur de résistance à l’antibiotique a été trouvéé dans des gènes codant pour des kinases, une protéine de type polycystine avec répétitions d’un domaine homologue de type lipoxygénase, des protéines du métabolisme de l’amidon, ou encore une méthyltransférase. Ces mutants forment un set de candidats devant être validés par complémentation pour une meilleure compréhension du métabolisme des lipides. Nous avons vu que la plupart des mutants défectueux dans la remobilisation des lipides de réserve sont aussi affectés dans celle de l’amidon. Ce lien potentiel entre les 2 processus est renforcé par le fait que dans 2 mutants connus de synthèse de l’amidon nous avons pu mettre en évidence un défaut de remobilisation des triglycérides. Ainsi, nous avons montré un lien d’interdépendance entre les dégradations des 2 formes majoritaires de réserves carbonées des microalgues.

Microalgae are able to accumulate high amounts of oil reserves, which make them promising candidates for biofuel production. Nevertheless, some technical and biological bottlenecks have to be overcome before a profitable industrial production. Increasing oil content per cell and discovering key proteins of oil metabolism is a major goal. We took a forward genetic approach and focused on isolating insertional mutants affected in oil remobilization following nitrogen resupply after a starvation phase. We setup and developed a medium- to highthroughput semi-quantitative oil content screening protocol, which has enabled isolation of >30 mutants. We identified the insertion loci in some of these mutants through the “genome walker” PCR-based method. The antibiotic marker was found to be inserted in genes encoding various proteins including serine-threonine kinases, a polycystin-related protein containing repetitions of a lipoxygenase homology domain, an E3 ubiquitin ligase, a starch metabolism protein and a methyltransferase. Mutants isolated provide a first set of candidate genes that remain to be validated by complementation and should contribute to a better understanding of lipid homeostasis in green microalgae. During the course of this work, we observed that most mutants defected in oil remobilization were also impaired in starch degradation. The occurrence of a link between the degradation of starch and oil was further strengthened by the fact that in two known starch-less mutants the oil remobilization process was found to be defected. This is the first evidence of an interdependency between the degradation processes of the major types of carbon reserves in microalgae.