Structure-function studies of human ribosome complexes

par Heena Khatter

Thèse de doctorat en Biophysique et biologie structurale

Sous la direction de Bruno Klaholz.

Soutenue le 18-09-2014

à Strasbourg , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....) , en partenariat avec Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (Strasbourg) (laboratoire) .

Le président du jury était Eric Westhof.

Les rapporteurs étaient Lasse Bohl Jenner, Yves Mechulam.

mots clés

• Ribosome
• Synthèse protéique
• 80S humain
• Terminaison de la traduction
• Ribosomes -- Relations structure-activité
• Synthèse protéique
• Génétique moléculaire humaine
• Expression génique

Titre traduit

Etudes structure-fonction de complexes du ribosome humain

Résumé

L’architecture et la régulation de la traduction eucaryote fut pendant longtemps un mystère pour les biologistes. Je présente ici un protocole détaillé pour purifier de manière homogène des ribosomes à partir de cellules HeLa, pour des études biochimiques mais également structurales. En utilisant ces ribosomes, j’ai obtenu des cristaux diffractant à faible résolution, pouvant être utilisés pour de futurs travaux. Une analyse par cryo-microscopie électronique (CME) a abouti à une structure à 5 A de résolution, permettant la construction d’un modèle. De plus, les facteurs eRF1 et eRF3 ont permis des premières études de la terminaison de la traduction par CME. Ces protéines en complexe ont également été étudiées par cristallographie aux rayons-X, montrant des interactions jusqu’alors jamais observées. L’ensemble de ce travail fournit des résultats importants pour la préparation et la description de la structure du ribosome humain, pavant la voie vers l’analyse de complexes fonctionnels.

mots clés

• Ribosome
• Synthesizing proteins
• Human 80S
• Translation termination

Résumé

Ribosomes comprise the translational machinery engaged in synthesizing proteins. The architecture and translation regulation of eukaryotic especially, human ribosomes, has been an enigma for a long time. I established a protocol for purifying homogenous ribosomes from HeLa cells which can be used for structural as well as biochemical analysis. Using these ribosomes, I obtained plate-like crystals of 80S diffracting to low resolution. A cryo electron microscopy analysis of these ribosomes yielded 5 Å resolution structure with secondary structures of rRNA and protein clearly visible. Furthermore, these ribosomes, along with the eukaryotic release factors (eRF1 and eRF3) purified by over-expression in bacteria, formed the basis for translation termination studies using cryo electron microscopy. Simultaneously, eRF1-eRF3 protein complex was explored by X-ray crystallography revealing new interactions. Together, this work paves the way for the analysis of functional ribosome complexes.