Sonde DNP/RMN du solide pour l'étude des protéines membranaires

DNP/solid state NMR probehead for the investigation of oriented membranes

• Auteur / Autrice : Hiba Sarrouj
• Direction : Burkhard Bechinger, Frank Engelke
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie physique
• Date : Soutenance le 09/01/2014
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie (Strasbourg ; 2005-....)
• Jury : Président / Présidente : Bruno Kieffer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Fabien Aussenac
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Clemens Glaubitz, Martial Piotto
• DOI : 10.70675/f26ecd68z6f03z4321zb45az170ae0d14e91

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectroscopie de la résonance magnétique nucléaire

Protéines membranaires

Peptides

Vecteurs de médicaments

Mots clés libres

Résonnance magnétique nucléaire (RMN)

Protéines membranaires

Dynamic nuclear polarisation (DNP)

Sonde RMN

Peptides antimicrobiens

PISEMA

Orientation peptidique

Cross polarisation (CP)

Nuclear magnetic resonance

Membrane proteins

Dynamic nuclear polarization (DNP)

Antimicrobial peptides

Peptide orientation

Cross polarization (CP)

Résumé

Les protéines membranaires en hélices alpha forment le tiers des protéines codées par notre génome. D’autres protéines membranaires sont formées typiquement de feuillets bêta. Leur fonction varie de la formation de pores, la transmission de signaux à l’activité antibiotique. Elles sont aussi capables de transporter de larges cargos comme les protéines ou les acides nucléiques au travers de la membrane. Récemment, les peptides ont émergé comme un moyen prometteur pour le transport de médicaments vers leurs cibles.Les protéines membranaires peuvent être synthétisées chimiquement ou exprimées et marquées isotopiquement dans les bactéries, isolées, purifiées et reconstituées dans les bicouches lipidiques hydratées. Elles présentent une variété de configurations en interagissant avec ces bicouches lipidiques. Ceci dépend de la composition et de l’épaisseur de ces bicouches. L’orientation des bicouches lipidiques est maintenue mécaniquement en les disposant entre des plaques de verre. La RMN du solide des échantillons orientés est un des moyens possibles pour accéder à la topologie des peptides associés à des membranes phospholipidiques. Les échantillons sont difficiles à exprimer dans les bactéries en grande quantités et possède une solubilité réduite en dehors des membranes. En outre leur taille est trop importante pour la RMN du liquide et il est difficile de les cristalliser. Un des inconvénients majeur de la spectroscopie RMN est sa faible sensibilité. Cela résulte du faible moment magnétique nucléaire qui résulte en un décalage Zeeman faible et donc une polarisation réduite. Par ailleurs, l’intensité du signal RMN dépend de plusieurs facteurs comme la quantité d’échantillon la polarisation et le champ magnétique B0. Et le temps d’acquisition de certaines expériences peut être très long. Le but de ce projet est d’obtenir plus de signal des protéines membranaires. Dès lors, nous avons développé une cryosonde DNP (dynamic nuclear polarization) / RMN du solide. La DNP est une technique ingénieuse qui est utilisée pour le transfert de polarisation des noyaux hautement polarisés à des noyaux moins polarisés par irradiation microonde. Les microondes vont exister sélectivement les électrons qui transfèreront leur polarisation à l’ensemble des protons voisins, le signal proton peut ainsi être augmenté de 660 fois.Pour cela la cryosonde DNP RMN du solide qui opère à 100 K et 9,4 T a été utilisée. Une sonde est la pièce mécanique qui maintient l’échantillon dans le centre magnétique de l’aimant du spectromètre. C’est une antenne modulable qui irradie et détecte des champs radiofréquence. La pièce centrale de la sonde est une bobine solénoïdale ou une bobine en forme de selle enveloppant l’échantillon. La faisabilité de ces expériences DNP a été validée sur les échantillons orientés en rotation à l’angle magique. Ces expériences ont été menées sur des échantillons enroulés dans un rotor. Même si leur orientation par rapport au champ magnétique B0 est perdue, une valeur d’augmentation de 17 a été obtenue.[...]

Helical membrane proteins comprise one third of the expressed proteins encoded in a typical genome. Other membrane proteins are typically beta sheets. Their function varies from pore formation, signaling to antimicrobial activity. They are also capable of transporting large cargo such as proteins or nucleic acids across the cell membrane. Recently, peptides have emerged as promising tools in drug delivery. Membrane proteins can be synthesized chemically or expressed and isotopically labeled in bacteria, isolated, purified and reconstituted into fully hydrated lipid bilayers. The bilayer orientation is kept mechanically by putting them between glass plates. While interacting with these bilayers they exhibit a variety of configurations depending on the lipids composition and thickness. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) on oriented bilayers is one way to access the topology of peptides associated with phospholipid membranes. Oriented membrane protein are difficult to study with analytical techniques because of their poor solubility outside the lipid membrane, difficulty of expression in bacteria in big quantities, difficulty to crystallize, and they are too large for solution NMR study. The intensity of an NMR signal depends on several factors such as polarization P and magnetic field magnitude B0. One of the major drawbacks of NMR spectroscopy is low sensitivity. This is caused by the small magnetic moment of the nuclear spins which results in a modest Zeeman splitting of the nuclear spin energy levels and therefore in a limited Boltzmann Polarization. The aim of this project is to obtain a better signal from membrane proteins. Thus a Low temperature (LT) solid state NMR with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) probe head was created. DNP is an ingenious technique that is used to transfer polarization from highly polarized targets to less polarized nuclei using microwave irradiation. Microwaves will excite selectively the electron spins which will transfer their polarization to the pool of proton nuclei, the proton NMR signal can be enhanced by 660 times. A probe head for DNP enhanced solid state NMR at 100 K and 9.4 T is described. A probe head includes the mechanical piece that holds the sample in the magnetic center of the NMR magnet. It is a tunable antenna that irradiates and detects the rf fields used in NMR. The centerpiece of the probe is the solenoidal or saddle coil surrounding the sample. The feasibility of such a DNP experiment is proven on magic angle oriented sample spinning. These experiments are conducted on oriented samples wrapped into a rotor. Through their orientation with regards to B0 is lost, enhancement values as high as 17 are obtained. [...]