Extended-Synaptotagmin 2 provides an essential activating platform in the immunological synapse to promote T lymphocytes differentiation

par Nassima Messali

Thèse de doctorat en Hématologie

Sous la direction de Alain Israël et de Robert Weil.

Soutenue en 2014

à Paris 7 .

mots clés

• Récepteur lymphocytaire T antigène, alpha-bêta
• Synapses immunologiques
• Lymphocytes T
• Facteur de transcription NF-kappa B

Titre traduit

ESYT2 constitue une plateforme de signalisation à la sinapse immunologique pour réguler les lymphocytes T

Résumé

T cell receptor (TCR) engagement triggers several downstream signaling cascades that control cell survival, proliferation and differentiation of T lymphocytes. One of the important events that occur downstream of the TCR enhancing the regulation of T lymphocyte functions, is the activation of the NF-icB pathway. Indeed, upon TCR engagement the activation of the kinase PKCO triggers the formation of the CARMAl/BCL10/MALT1 (CBM) signalosome and its recruitment to the immunological synapse. The localization of the CBM complex to the synaptic membrane constitutes one of the key steps leading to the activation of the IKK complex, the core element of the NF-KB pathway. This recruitment to the immunological synapse is regulated by the SH3 domain of CARMA1 that interacts with an unknown plasma membrane protein. Recently, members of extended-synaptotagmins family (ESYTs) have been identified as endoplasmic reticulum anchored proteins that mediate contact with the plasma membrane. Among these members, we identified through a genetic approach, Extended-Synaptotagmin 2 (ESYT2) as a new interacting protein of the SH3 domain of CARMAl. We showed that ESYT2 interacts with CARMA1 in an inducible manner following the TCR stimulation in jurkat cells or the expression of the constitutive active form of PKCO in HEK-293T cells. We also demonstrated that ESYT2 mediates antigen signaling by controlling the recruitment of the CBM complex, PKCO, ADAP, NEMO and the endoplasmic reticulum to the Immunological Synapse. Moreover, we generated mice lacking ESYT2 to better understand the physiological role of ESYT2 in the activation of T lymphocytes. Analyses of these mice showed that ESYT2 is involVed in the up-regulation of CD69 and the differentiation of naïve CD4 T cells to effector and memory CD4 cells. Following TCR stimulation, ESYT2-depleted jurkat cells and mature ESYT2-deficient CD4 T cells showed a defect in the activation of the NF-KB pathway. In addition, heterozygous and homozygous knockout mice showed a severe dermatitis. Together, these results show that ESYT2 orchestrates the recruitment of the CBM complex to the immunological synapse to probably ensure cell differentiation and functions that shape up the immune adaptive response.

Résumé

L'engagement de récepteur des lymphocytes T (TCR) induit une cascade de signalisation qui aboutit à l'activation des facteurs de transcriptions qui régulent la survie, la différenciation et la prolifération des lymphocytes T. Une des cascades qui régulent ces processus est la voie de signalisation NF-KB. En effet, l'engagement de TCR induit la formation d'une structure organisée appelée la synapse immunologique ou se localise toutes les protéines impliquées dans cette voie de signalisation, dont la kinase PKCO et le complexe CARMA1/BCL10/MALT1 (CBM). CARMAI, une protéine adaptatrice de la famille MAGUK, est phosphorylée par PKCO. Cet évènement provoque un changement de conformation de la protéine, lui permettant d'interagir avec BCL10 et MALT1 et de former ainsi le complexe CBM qui est recruté transitoirement à la synapse immunologique via le domaine SH3 de CARMAI. Cette localisation à la synapse immunologique constitue une étape clé pour l'induction du complexe IKK, l'élément principale de l'activation de la voie NF- KB. Cependant, la protéine régulant la localisation de CARMAI à la synapse immune reste inconnue. Récemment, les membres de la famille ESYTs, pour Extanded Synaptotagmin protéines, ont été identifiés comme des molécules associées au réticulum endoplasmique responsable de la formation des jonctions entr( le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique (RE-MP). Parmi ces membres, nous avons identifié, par une approche génétique, ESYT2 comme une protéine interagissant avec le domaine SH3 de CARMAI. Nous avons montré que ESYT2 interagit avec CARMAI d'une façon inductible après stimulation du TCR dan: les cellules jurkat ou après surexpression de la forme constitutivement active de PKCO dans les cellules HEK¬293T. Nous avons aussi montré que ESYT2 régule la localisation du complexe CBM, PKCO, ADAP, NEMO et le réticulum endoplasmique à la synapse immunologique. En outre nous avons généré des souris qui n'expriment pas ESYT2 pour mieux comprendre le rôle physiologique de cette protéine dans l'activation des lymphocytes T. Les études expérimentales de ces souris montrent que ESYT2 est impliqué dans la régulatior positive de l'expression de CD69 et la différenciation des cellules CD4+ T naïves à des cellules CD4+ T effectrices et mémoires. Suite à une stimulation TCR, les cellules déplétées pour ESYT2 ainsi que les cellules CD4+ déficientes pour ESYT2, présentent des défauts d'activation de la voie de signalisation NF-KB. En outre, les souris hétérozygotes et homozygotes déficientes pour ESYT2 développent des dermatites sévères. En résumé, nos résultats montrent que ESYT2 contrôle le recrutement de protéines clé dont le complexe CBM à la synapse immunologique pour réguler la différenciation et probablement al survie des lymphocytes 7