Etude des mécanismes moléculaires de l'initiation de la traduction de l'ARN génomique du VIH-1

Molecular mechanisms of translation initiation of the genomic RNA of HIV-1

• Auteur / Autrice : Jules Deforges
• Direction : Bruno Sargueil
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 27/03/2014
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Reynald Gillet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Sargueil, Reynald Gillet, Jean-Christophe Paillart, Franck Martin, Marc Graille
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Christophe Paillart, Franck Martin

Mots clés

Mots clés contrôlés

VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1)

Traduction génétique

Site d'entrée interne des ribosomes

ARN viral

Mots clés libres

ARN

Traduction

IRES

Initiation ribosome

VIH-1

Structure secondaire

SHAPE

Biologie moléculaire

Dimérisation

Virus

Résumé

L’ARN génomique du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est multifonctionnel et suit au moins deux destins. Soit il est traduit par la machinerie traductionnelle de l’hôte donnant naissance aux polyprotéines Gag et Gag-pol, soit il se dimérise et est encapsidé dans les virions en tant que génome viral. Les travaux du laboratoire visent à identifier les mécanismes moléculaires de la traduction de l’ARN génomique et de sa dimérisation, ainsi que les déterminants gouvernant la balance entre ces deux phénomènes. La traduction de l’ARN génomique viral peut être initiée de trois façons. Selon le mécanisme canonique nécessitant la présence d’une coiffe à l’extrémité 5’ de l’ARN, et grâce à deux sites d’initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Un IRES a été mis en évidence dans la 5’ UTR, dont l’activité est stimulée lors en phase G2/M du cycle cellulaire uniquement. Un second IRES a été découvert dans la région codante de gag. Il est capable de lier directement la petite sous-unité ribosome et le facteur d’initiation eIF3, et permet l’initiation à partir de deux codons AUG situés dans la même phase de lecture, conduisant à la synthèse d’une isoforme additionnelle de Gag. Mon projet de thèse a consisté en l’étude de l’influence de la structure secondaire sur la traduction et la dimérisation. Dans un premier temps, j’ai mis en place au laboratoire une nouvelle technique de sondage de structure, appelée « SHAPE », développée par le laboratoire de K. Weeks. Le SHAPE nous permet désormais de sonder rapidement la structure secondaire de nombreux ARN, et notamment de tester en routine l’effet de mutations sur la structure secondaire. Cette technique a permis d’étudier la structure secondaire de la 5’ UTR dans différentes conditions. Nous avons ainsi identifié une signature de la conformation monomère de la 5 UTR, et découvert un nouvel élément impliqué dans la dimérisation in vitro. Par ailleurs, nous avons montré que des extraits de cellules Hela synchronisées en phase G2/M du cycle cellulaire stimulent l’activité de l’IRES de la 5’ UTR et modifient le profil de réactivité de cette région, traduisant probablement une réorganisation structurale induite par le recrutement de protéines cellulaires. Une autre partie de mon projet de thèse a concerné l’étude de l’IRES de la région codante de gag, Des délétions progressives de l’IRES, à partir des extrémités 5’ et 3’ ont mis en évidence l’existence de deux sites de liaison distincts au ribosome, localisés à proximité de chacun des deux codons d’initiation. La délétion de chaque site a permis de confirmer le rôle de la liaison directe au ribosome dans la traduction de gag. L’ensemble de ces éléments nous permet de proposer un modèle moléculaire conduisant à la formation des complexes d’initiation sur chaque codon AUG. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu’une interaction longue-distance entre la boucle PolyA et la région codante de gag régule de la traduction de l’ARN génomique. Un tel mécanisme pourrait permettre de réguler l’efficacité de traduction du gène gag, voire du ratio entre les deux isoformes au cours du cycle réplicatif.

Primate lentiviruses genomic RNA can serve both as an mRNA that encodes for Gag and Gag-Pol polyproteins and as a propagated genome. We previously reported the presence of an IRES activity embedded within Gag coding region itself that drives the production of several isoforms of the Gag polyprotein and that is conserved in HIV-1, HIV-2 and SIVmac. In addition, in vitro reconstitution experiments revealed that the initial step of initiation complex formation is the recruitment of the 40S ribosomal subunit and eIF3. The structural and functional conservation amongst lentiviruses indicates that those properties are important for the virus cycle. In order to define the RNA structural determinants responsible for the formation of IRES/eIF3/40S ternary complex, we have been following functional and biochemical approaches in parallel. Our results indicate that 2 distinct binding sites for the ribosome are present close to the 2 AUG codons used as initiation site for the translation. Further biochemical analyses have shown that 2 ribosomes can be recruited by the same RNA molecule. In order to determine the functional role of the IRES activity on gag translation, we assayed in vitro the translation efficiency of mutants unable to recruit the ribosome. In parallel, we have been following a drug screening strategy to identify small molecules that would inhibit the ribosome recruitment. This approach could pave the way to the definition of the IRESgag as a new therapeutic target, and to the identification of new drugs.