Étude phytochimique, évaluation pharmacologique, antimicrobien (sic) et toxicologique de Rourea induta Planch. (Connaraceae)

• Auteur / Autrice : Milena Kalegari
• Direction : Didier Stien, Miguel Obdulio Gomes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Paris, Muséum national d'histoire naturelle
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Laïla Salmen Espindola
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yanna Dantas Rattman
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jorge Alberto López Rodriguez, Alexandre Bella Cruz

Mots clés

Mots clés contrôlés

Toxicologie

Bactéries -- Effets des médicaments

Pharmacologie

Chimie végétale

Rourea induta

Résumé

L’espèce Rourea induta Planch. , (Connaraceae), populairement connu comme campeira, chapeudinha –pau-de-porco n’a été que peu étudié dans la littérature alors même que des espèces de la même famille possèdent des activités pharmacologiques intéressantes. Le but de cette étude était d'évaluer les caractéristiques phytochimiques des extraits et fractions obtenus à partir des feuilles de cette plante et de vérifier leurs activités antinociceptive, anti-inflammatoire, anti-parasitaire, antifongique et antibactérienne ainsi que leur toxicité. Treize composés ont été isolés et identifiés ; de la fraction à l’acétate d'éthyle : épicatéchine, guaijavérine, isoquercétrine, ester méthylique de l'acide 5-O-caféoylquinique et procyanidine B2 ; de l’extrait aqueux : procyanidine C1, acide néoclorogénique et acide chlorogénique ; et de la fraction chloroforme filtrée sur polyamide : (6S,9S)-roséoside, (6S,9R)-roséoside, citroside A, byzantionoside B et glucoside de bluménol C. Une méthode HPLC pour la quantification du composé marqueur de l’extraire, hyperine, précédemment isolé et identifié, a été developpé et validé L'activité antinociceptive a été évaluée in vivo par le test au formol, dans lequel l'extrait aqueux (100 mg/kg; v. O. ) a inhibé les deux phases, démontrant une activité antinociceptive et anti-inflammatoire. Dans le test d'allodynie mécanique (CFA 70%), l’extrait aqueux (100 mg/kg ; v. O. ) réduit l'allodynie et possède un effet anti-inflammatoire par réduction de la concentration en TNF-α et IL-1β dans la patte et la moelle osseuse de souris. Il est également capable d'inhiber la nociception provoquée par le TNF-α en injection intrathécale. Le système opioïde n'est pas impliqué dans le mécanisme d'action antinociceptive de l'extrait aqueux. Les capacités antioxydante et hépatoprotectrice ont été évaluées avec l'extrait éthanolique (500 mg/kg ; v. O. , 7 jours) chez des rats avec des lésions hépatiques induites par le tétrachlorure de carbone (CCl4). L'extrait à l'éthanol a montré une action protectrice contre les blessures du foie induites par le CCl4 comme en témoigne la réduction considérable des activités des enzymes marqueurs sériques de lésions hépatiques (ALT et AST). L'extrait restaure également le déséquilibre induit par le CCl4. En effet, la peroxydation lipidique (TBARS) est réduite et la teneur en glutathion et les concentrations des enzymes impliquées dans le système de défense antioxydant (SOD, CAT, GPx) reviennent à des valeurs proches de la normale. L’activité hepatoprotectrice a été confirmée par l'analyse histologique du foie. Dans l'évaluation de la toxicité aiguë chez la souris, les extraits à l’éthanol et à l’eau administrés en une seule dose ont montré des signes de toxicité rénale et hépatique légère à des doses assez élevées (300 et 2000 µg/kg ; v. O. ). L'activité anti-inflammatoire in vitro évaluée par la production d'oxyde nitrique par les cellules RAW264. 7 a été démontrée pour la fraction au chloroforme et celle au chloroforme filtrée sur résine de polyamide (50% d'inhibition à 100 µg/ml). Les trois glycosides isolés [(6S,9S)-roséoside, byzantionoside et glucoside de bluménol C] sont également actifs dans ce même test (30 % d'inhibition à 50 µg/ml). La production de TNF-α par les cellules est inhibée par les extraits aqueux, à l’éthanol et la fraction à l’acétate d’éthyle tous filtrés sur polyamide (100 µg/ml avec 5h stimulation par le LPS). L'activité antimicrobienne a été évaluée par la mesure de la concentration minimale inhibitrice. Il n’y a pas de activité antileishmanienne et antitrypanosomale pour tous les échantillons testés. Les fractions à l'acétate d'éthyle (CIM = 64 µg/ml), à l’hexane (CIM = 256 µg/ml) et au chloroforme (CIM = 256 µg/mL) sont actives contre C. Albicans, et les deux premières sont également actives vis-à-vis de C. Parapsilosis (respectivement CIM =16 et 64 mg/mL). Les extraits aqueux et éthanolique ont montré une activité contre les bactéries à Gram positif S. Aureus (respectivement CIM = 39 et 78 µg/mL) et E. Faecalis (CIM = 78 µg/mL). L’activité est plus faible contre les bactéries à Gram négatif E. Coli et P. Aeruginosa. La fraction à l’acétate d'éthyle est active contre les deux types de bactéries. Aucun échantillon n’a présenté de cytotoxicité contre les cellules MRC5 et KB. D’éventuelles activités hémolytiques n’ont pas non plus été détectées. Par conséquent, il semble que les extraits évalués dans cette étude ne soient pas toxiques. Ces résultats sont encourageant et de ce fait, les feuilles de R. Induta peuvent être considérées intéressants dans le contexte la recherche et du développement de nouveaux médicaments.

The species Rourea induta Planch. , (Connaraceae), popularly known as campeira, chapeudinha or pau-de-porco, has few studies reported in the literature, but many species in this family have interesting pharmacological activities described. The aim of this study was evaluate the phytochemical characteristics, the antinociceptive, anti-inflammatory, antiparasitic, antifungal, antibacterial and toxicity of extracts and fractions from the leaves from Rourea induta. Were isolated and identified thirteen compounds, from the ethyl acetate fraction: epicatechin, guaijaverine, isoquercetrine, 5-O-caffeoylquinic acid methyl ester and procyanidin B2; from aqueous extract: procyanidin C1, chlorogenic acid, and neochlorogenic acid; and from chloroform fraction filtered in polyamide: (6S,9S)-roseoside, (6S,9R)-roseoside, citroside A, byzantionoside B and blumenol C glucoside. An HPLC method for the extract marker compound quantification, the hyperin, isolated and identified previously, was developed and validated. The antinociceptive activity was evaluated in vivo by the formalin injection test, whereby the aqueous extract (100 mg/kg; p. O. ) showed inhibition in both phases, showing antinociceptive and antiinflammatory activity. In mechanical allodynia evaluation (70% CFA), the aqueous extract (100 mg/kg; p. O. ) showed reduction of allodynia and showed anti-inflammatory effect by reducing cytokines TNF-α and IL-1β in mice paw and spinal cord, which was also able to reduce the nociception caused by TNF-α intrathecal injection. The opioid system is not involved as the antinociceptive mechanism of aqueous extract action. The antioxidant potential and the liver protection potential were evaluated with the ethanol extract (500 mg/kg; p. O. 7 days) in rats with carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. The ethanolic extract showed a protective action against liver injury evidenced by significant decrease of liver injury serum enzymes markers (ALT and AST). The extract also restored the imbalance induced by CCl4 as evidenced by the decrease in lipid peroxidation (TBARS), the increase of glutathione content and antioxidant defense system enzyme (SOD, CAT, GPx) to values close to normal. The hepatoprotective effect was confirmed by liver histological analysis. For acute toxicity evaluation in mice, ethanolic and aqueous extracts showed mild signs of kidney and liver toxicity in highest doses (300 and 2000 mg/kg p. O. ) when administered as a single dose. In vitro anti-inflammatory activity, evaluated by RAW264. 7 cells nitric oxide production, was demonstrated by chloroform fraction and polyamide-filtered chloroform fraction (100 µg/mL) (50% inhibition), and the three isolated glycosides (6S,9S)-roseoside, byzantionoside B and blumenol C glucoside (30% inhibition) (50 µg/mL). TNF-α production by these cells was inhibited by polyamide-filtered aqueous extract, polyamide-filtered ethanol extract and polyamide-filtered ethyl acetate fraction (100 µg/mL) with 5h of LPS stimulation. Antimicrobial activity was evaluated by minimum inhibitory concentration. The samples tested showed no activity towards Leishmania braziliensis and Trypanossma cruzi. In the antifungal test, ethyl acetate (MIC = 64 µg/mL), hexane (MIC =256 µg/mL) and chloroform (MIC = 256 µg/mL) fractions showed activity against C. Albicans, and the first two were also active against C. Parapsilosis (MIC = 16 and 64 µg/mL respectively). Aqueous and ethanolic extracts showed activity against the Gram positive bacteria S. Aureus (MIC = 39 and 78 µg/mL respectively) and E. Faecalis (78 µg/mL), and reduced activity against the Gram-negative bacteria E. Coli and P. Aeruginosa. Ethyl acetate fraction showed activity against both types of bacteria. No sample was cytotoxic against KB and MRC5 cells. No hemolytic activity was recorded either, so these fractions do not seen to be toxic. These results encourage further research with R. Induta leaf extracts and these extracts can be considered as promising in the context of new drugs research and development.