Caractérisation biochimique et fonctionnelle de nouveaux anticorps monoclonaux anti-galectine-9 en vue d'applications diagnostiques et thérapeutiques

Biochemical and functional charcterization of new monoclonal antibodies targeted against galectin-9 for diagnostic and therapeutic applications

• Auteur / Autrice : Clément Barjon
• Direction : Pierre Busson, Ming Wei
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Cancérologie, Immunologie, Biologie cellulaire, Biochimie
• Date : Soutenance le 05/02/2013
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Institut de cancérologie Gustave Roussy (France)
• Jury : Président / Présidente : Christian Auclair
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Busson, Ming Wei, Christian Auclair, Frédéric Ducancel, Michel Vidal, Stéphane Depil
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Frédéric Ducancel, Michel Vidal

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anticorps monoclonaux

Immunologie

Cancer

Mots clés libres

Galectine-9

Cancer

Immunologie

Biologie cellulaire

Anticorps monoclonaux

Galectin-9

Cancer

Immunology

Cellular biology

Monoclonal antibodies

Résumé

La galectine-9 est une lectine animale principalement exprimée dans un contexte inflammatoire et possédant des propriétés à la fois pro-inflammatoires et immunosuppressives. Elle induit la production de cytokines inflammatoires par les cellules du système immunitaire inné tandis qu’elle induit l’apoptose des lymphocytes Th1 CD4+ et favorise l’expansion des lymphocytes Treg. Les propriétés immunomodulatrices de la galectine-9 dépendent en grande partie de son interaction avec le récepteur TIM-3. Cependant, ces deux molécules interagissent chacune avec d’autres protéines et dans plusieurs contextes la responsabilité de l’interaction galectine-9/TIM-3 n’a pas été formellement démontrée. Le développement d’un anticorps neutralisant les effets de la galectine-9 permettrait de préciser son rôle exact dans ces contextes. Par ailleurs, le blocage des voies de signalisations inhibitrices du système immunitaire est aujourd’hui un enjeu majeur en oncologie, comme le démontre le succès récent de la neutralisation du récepteur inhibiteur CTLA-4 pour le traitement des mélanomes. Nous avons produit de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine 9 par immunisation de souris avec la partie C-terminale de la protéine. Parmi ces anticorps, 1G3 permet la détection de la galectine-9 sur coupes de tissus humains d’une manière très sensible et spécifique en immunohistochimie. Son utilisation nous a permis de confirmer l’expression constante et intense de la galectine-9 dans les cellules malignes de carcinome nasopharyngé et la forte expression de la galectine-9 dans les cellules de Kupffer présentes dans les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite C. Pour la première fois, nous avons mis en évidence une expression de la galectine-9 dans les leukocytes infiltrant les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite B. De plus, nous observons une expression de la galectine-9 dans les hépatocytes infectés par ces deux virus, ce qui n’avait pas été démontré jusqu’à présent. Nous avons également caractérisé les capacités fonctionnelles de nos anticorps lors de tests in vitro. L’anticorps 2E12 bloque la fixation de la galectine-9 au récepteur TIM-3 dans un test acellulaire, neutralise l’apoptose induite par la galectine-9 sur cellules de lymphomes T humaines et réduit considérablement l’augmentation de calcium cytosolique induite par la galectine-9 dans les cellules Jurkat. Ces effets de la galectine-9 sont indépendants de TIM-3 dans ce modèle cellulaire. L’anticorps 2E12 constitue un outil puissant pour étudier les fonctions de la galectine-9 à la fois dépendantes et indépendantes de TIM-3.

Galectin-9 is an animal lectin mainly expressed in an inflammatory context which possesses both pro-inflammatory and immunosuppressive properties. It induces inflammatory cytokines production from innate immunity cells whereas it induces apoptosis of Th1 CD4+ lymphocytes and enhance T regulatory lymphocytes expansion. Galectin-9 immunomodulatory properties depends mostly on its interaction with TIM-3 receptor. However, both molecules interact with other proteins, and in several contexts, galectin-9/TIM-3 interaction responsability has not been formally demonstrated. Development of a galectin-9 neutralizing antibody would allow to determine its precise role in those contexts. Moreover, blocking of immune system inhibition pathways is nowaday a major concern in oncology, as the success of CTLA-4 antagonist used for melanoma treatment recently demonstrated. We have produced new monoclonal antibodies against galectin-9 through immunisation of mice with the C-terminus part of the protein. Among those antibodies, 1G3 allows the detection of galectin-9 on human tissue samples in a very sensitive and specific manner in immunohistochemistry. Using 1G3, we could confirm intense and constant expression of galectin-9 in nasopharyngeal carcinoma malignant cells and its strong expression in Kupffer cells infiltrating hepatitis C-infected liver tissue. For the first time, we demonstrated expression of galectin-9 in leukocytes infiltrating hepatitis B-infected liver tissue. Additionally, we could observe galectin-9 expression in infected hepatocytes for both viruses, which had not been demonstrated until now.We also characterized functional properties of our antibodies during in vitro tests. The 2E12 antibody blocks galectin-9 interaction with TIM-3 in an cell-free assay, neutralizes galectin-9-induced apoptosis of human T lymphomas cells and considerably reduces galectin-9-induced increase of intracellular calcium in Jurkat cells. Those effects are independent of TIM-3 in this cell line model. The 2E12 antibody constitutes a powerful too to study both TIM-3-dependent and TIM-3-independent functions of galectin-9.