Développement de stratégies thérapeutiques de trans-épissage pour la maladie de Huntington et la dystrophie musculaire de Duchenne, et étude du maintien des vecteurs AAV dans un contexte musculaire dystrophique
par Maëva Le Hir
Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaires
Sous la direction de Luis Garcia.
Soutenue en 2013
à Paris 6 .
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Résumé
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est due à des mutations du gène DMD causant l’absence de protéine dystrophine (Dys). La structure modulaire de la Dys a permis d’envisager une stratégie de saut d’exon thérapeutique pour permettre l’expression d’une Dys tronquée mais fonctionnelle. Tous les exons n’étant pas dispensables, l’équipe a développé une stratégie de trans-épissage thérapeutique (TET) pour réparer la fin des transcrits DMD. Des transcrits réparés ainsi que de la Dys issue du TET ont été détectés in vivo. Une stratégie d’échange d’exon (EE) a aussi été développée, a fait ses preuves in vitro puis a été évaluée in vivo chez des souris wt et mdx par injection de vecteurs AAV exprimant les molécules d’EE. La détection des génomes viraux (GV) a révélé une différence du nombre de GV présents dans les muscles injectés wt vs mdx, nous faisant supputer que les cycles de dégénérescence/régénération caractérisant les muscles dystrophiques pouvaient causer une perte des GV. Nous avons étudié le maintien des GV d’AAV dans 3 modèles DMD : les souris mdx et double KO (DMD-/-UTRN-/-), et le chien GRMD. Une perte des GV a été observée dans ces 3 modèles : à court terme si la dose de vecteur thérapeutique injectée est insuffisante ou si le vecteur n’est pas thérapeutique, et à long terme après injection d’une dose optimale de vecteur thérapeutique. Le TET étant pertinent pour les maladies dominantes, nous avons développé une stratégie de TET pour réparer les transcrits HTT, dont l’expansion de la séquence polyQ de l’exon 1 cause la maladie de Huntington. Des transcrits trans-épissés ont été détectés in vitro de façon reproductible, mais en faible quantité.
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Titre traduit
Development of therapeutic strategies of trans-épissage for the disease of Huntington and the muscular dystrophy of Duchenne, and the study of the preservation of vectors AAV in a muscular dystrophique context
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Résumé
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by mutations in DMD gene which abolish the synthesis of dystrophin protein (Dys). The modular structure of Dys allowed to imagine a therapeutic exon skipping strategy, in order to express a truncated but functional Dys. As all exons are not dispensable, a therapeutic trans-splicing strategy has been developed in the team to repair the end of DMD transcripts. Repaired transcripts and a small amount of dystrophin resulting from trans-spliced transcripts were detected in vivo. An exon exchange (EE) strategy was also developed, and showed its efficiency in vitro. It was then tested in vivo in wt and mdx mice by injections of AAV vectors encoding exon exchange molecules. The detection of AAV viral genomes (VG) revealed an important difference between VG copy numbers contained in wt vs mdx injected muscles, suggesting that degeneration/regeneration cycles characterising dystrophic muscles could cause a loss of VG. We studied AAV VG persistence in three models of DMD: mdx and double KO (DMD-/-UTRN-/-) mice, and GRMD dog. A loss of VG was observed in the three models: in the short term when the dose of therapeutic vector injected is unsufficient or when the vector is not therapeutic, and in the long term even when an optimal dose of therapeutic vector is injected. As therapeutic trans-splicing is relevant for dominant diseases, we developed a trans-splicing strategy to repair HTT transcripts, in which polyQ sequence expansion in exon 1 leads to Huntington disease. We developed pre-trans-splicing molecules and tested them in vitro: trans-spliced transcripts were detected in a reproducible way, but always in low amounts.
