Characterization of tomato SIARF family and SIARF8A variants reveals a selective transcriptional control of arf8 by alternative splicing and mirna stress in auxinmediated fruit set

Identification des membres de la famille de gènes codant pour les ARF chez la tomate et décryptage du rôle central du gène SlARF8 dans le mécanisme contrôlant la formation des fruits et la parthénocarpie

• Auteur / Autrice : Yongyao Fu
• Direction : Mondher Bouzayen, Mohammed Zouine
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Développement des Plantes
• Date : Soutenance le 03/12/2013
• Etablissement(s) : Toulouse, INPT
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génomique et Biotechnologie des Fruits

Mots clés

Mots clés libres

Auxine

Solanum lycopersium

ARF famille

SlARF8A/B

MiARN

Parthénocarpie

Auxin

Solanum lycopersium

ARF family

SlARF8A/B

MiRNA

Parthenocarpy

Résumé

La formation des fruits charnus est un processus de développement impliquant trois stades principaux : (i) la transition fleur/fruit ou nouaison, (ii) la croissance et enfin (iii) la maturation des fruits. Chacune de ces étapes correspond à une transition développementale associée à d’importants changements physiologiques et structurels. Parmi toutes les hormones, l’auxine est connue pour jouer un rôle important dans l‟initiation et la coordination du processus de nouaison et des phases précoces de développement du fruit. La mise en place de la réponse à l‟auxine nécessite l‟intervention de facteurs de transcription appartenant à la famille des ARF (Axin Response Factor) connus pour réguler l‟expression des gènes de réponse précoce à l‟hormone en se liant aux Cis-éléments de type AuxRE (Auxin Response Element) possédant le motif conservé de réponse à l‟auxine. Les ARF sont de ce fait des candidats forts pour faire partie du mécanisme moléculaire par lequel l’auxine intervient dans le processus de nouaison. Le projet de recherche réalisé au cours de la thèse a permis d‟isoler et de caractériser au total 22 gènes Sl-ARF chez la tomate (Solanum lycopersicum), la plante modèle pour l’étude du développement et de la maturation des fruits charnus. Les gènes Sl-ARF montrent des profils d‟expression distincts selon les tissus et organes considérés, suggérant des fonctions spécifiques pour les membres de cette famille multigénique. Il est de plus montré que certains gènes Sl-ARF sont régulés à la fois par l’auxine et par l’éthylène, suggérant qu‟ils participent potentiellement au dialogue entre les voies de signalisation des deux hormones. L’expression transitoire a révélé la capacité des Sl-ARF à agir comme activateur ou répresseur transcriptionnel des gènes de réponse à l’auxine. L‟étude des profils d’expression globale, réalisée par RNA-seq à l‟échelle du génome entier, a révélé pour la première fois l‟existence d‟un niveau important de régulation par épissage alternatif des ARFs pendant la transition fleur-fruit. La localisation nucléaire des protéines Sl-ARF8A / B a été déterminée par fusion avec le gène rapporteur GFP puis expression dans un système "signle cell". L‟étude d’expression a révélé des profils distinctifs entre ARF8A et ARF8B avec une augmentation notable des transcrits Sl-ARF8A suite à la pollinisation des fleurs. Le rôle physiologique du gène Sl-ARF8A a été par la suite abordé par une approche de génétique inverse fournissant un nouvel éclairage sur les événements moléculaires qui sous-tendent la mise à fruit. La surexpression de Sl- ARF8 dans la tomate engendre des phénotypes pléiotropiques touchant la croissance - 4 - végétative (réduction de la taille des plantes, altération du développement racinaire et des tiges latérales) et l‟appareil reproducteur avec la formation de fruits parthénocarpiques (absence de graines). L’analyse histologique a révélé une modification notable du placenta et des ovules chez les lignées de sur-expression de Sl-ARF8 et les études par RNA-Seq ont identifié plus de 2632 gènes différentiellement exprimés chez les surexpresseurs par comparaison avec les lignées non transformées. Au total, l‟étude réalisée au cours de la thèse fournit une description exhaustive de la famille des ARF chez la tomate et une caractérisation fonctionnelle du gène Sl-ARF8 qui souligne son rôle comme figure centrale du mécanisme de contrôle de la nouaison des fruits.

The making of a fleshy fruit is a developmental process involving three main stages known as (i) fruit set, (ii) fruit growth and (ii) fruit ripening each corresponding to a transition step associated with major physiological and structural changes. Among other hormones, auxin is known to play a dynamic role in triggering and coordinating the changes associated with the process of fruit set and early fruit development. Auxin responses are mediated at the transcriptional level by Auxin Response Factors (ARFs) which regulate early auxin-responsive genes by specific binding to TGTCTC Auxin Response Elements (AuxREs). ARFs are therefore good candidates for being among the components of the molecular mechanism by which auxin mediates the fruit set. In the present study, a total of 22 Sl-ARF genes have been isolated and characterized in tomato (Solanum lycopersicum), a model plant for the study of fleshy fruit development and ripening. Expression profiling revealed distinctive patterns for Sl-ARF genes in different tomato tissues. Hormone treatment indicated that Sl-ARFs can be regulated both by auxin and ethylene with Sl-ARF2B, 5 and 9 likely to be involved in the cross-talk between the two hormones. Transient expression using a single cell system uncovered the ability of Sl- ARFs to act either as transcriptional activator or repressor in regulating the expression of auxin-responsive genes. Genome-wide expression profiling performed by deep RNASequencing revealed for the first time the importance of the alternative splicing mode of regulation of ARF genes during tomato fruit set. The physiological significance of two closely related Sl-ARFs, Sl-ARF8A and Sl-ARF8B, was addressed in the present study via a reverse genetics approach providing new insight on the molecular events underlying tomato fruit set. Fusion to GFP reporter gene indicated that both Sl-ARF8A/B proteins are nuclear localized. Expression analysis by RT-qPCR revealed some distinctive features between Sl-ARF8A and Sl-ARF8B with a notable increase in Sl-ARF8A transcript upon flower pollination. Over-expression of Sl-ARF8A/B in tomato resulted in pleiotropic phenotypes, including dwarf plants, altered root and lateral shoot development and parthenocarpic fruits (seedless). Histological analysis revealed altered placenta and ovules development in SlARF8A-OX flowers and RNA-Seq profiling identified over 2632 differentially expressed (DE) genes in SlARF8A-OX flower buds compared to wild type control plants. Considering the dramatic change in gene expression of genes related to auxin, jasmonate and ethylene displayed in SlARF8A-OX lines, these phytohormones are likely to play an active role in coordinating the fruit set process. Altogether, the present - 6 - study provided a comphensive description of the tomato ARF gene family and a functional characterization of Sl-ARF8 defining this ARF member as a central figure of the control mechanism of the fruit set process.