Développement de la technologie des récepteurs couplés à un canal ionique pour des études structure-fonction des récepteurs couplés aux protéines G et du canal Kir6.2

Development of the Ion Channel-Coupled Receptor technology in structure-function studies of G protein-coupled receptors and Kir6.2 channel.

• Auteur / Autrice : Katarzyna Niescierowicz
• Direction : Michel Vivaudou, Christophe Moreau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 21/10/2013
• Etablissement(s) : Grenoble
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Institut de Biologie Structurale
• Jury : Président / Présidente : Franck Fieschi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Charnet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Gildas Loussouarn, Bernard Mouillac

Mots clés

Mots clés libres

GPCR

Canal KATP

Biocapteur

Électrophysiologie (patch–clamp)

Double micro–électrodes)

Ingénierie moléculaire

Patch clamp

GPCR

Artificial ion channels

G protein-coupled receptor

Résumé

Les Récepteurs Couplés à un Canal Ionique (ICCRs) sont des canaux ioniques artificielscréés par fusion d'un Récepteur Couplé aux Protéines G (RCPG) au canal ionique Kir6.2. Dansce concept, le canal agit comme un rapporteur direct des changements conformationnels desRCPGs permettant de détecter par simple mesure de courant, la fixation d'agonistes etd'antagonistes proportionnellement à leur concentration.Le signal induit étant directement corrélé à l'activité du récepteur, indépendamment desvoies de signalisation des protéines G, nous avons exploité cet avantage pour étendre le champd'applications des ICCRs au cours de cette thèse. Nous avons développé quatre applications quisont: 1) la caractérisation fonctionnelle des RCPG optimisés pour la cristallisation par insertionde domaine du lysozyme du phage T4 dans la boucle ICL3; 2) la détection de la dépendance desRCPGs au cholestérol; 3) la détection de ligands dits ''biaisés'' pour faciliter leur criblage; et 4) lacartographie fonctionnelle des portes du canal Kir6.2 régulées par des protéines membranairesinteragissant par le domaine N-terminal.

Ion Channel-Coupled Receptors (ICCRs) are artificial ion channels created by the fusion of a Gprotein-coupled receptor to a Kir6.2 channel. In this concept, the channel acts a direct reporter ofthe conformational changes of the GPCRs, allowing the detection by simple current recordingsof agonists and antagonists binding in concentration-dependent manner.The signal being directly correlated to the receptor activity, independently of G protein signallingpathways, we exploited this advantage to extend the field of applications of ICCRs during thisthesis. We developed 4 applications: 1) the functional characterization of the optimized GPCRsfor crystallization by insertion of the T4 phage lysozyme domain in the ICL3 loop; 2) thedetection of a cholesterol-dependence of the GPCRs; 3) the detection of the so-called ''biasedligands'' to simplify their screening; and 4) the functional mapping of the Kir6.2 channel gatesunder control of membrane proteins interaction with the N-terminus domain.