Imagerie Quantitative du Collagène par Génération de Seconde Harmonique

Quantitative Imaging of Collagen by Second Harmonic Generation

• Auteur / Autrice : Stéphane Bancelin
• Direction : Marie-Claire Schanne-Klein
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Palaiseau, Ecole polytechnique

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ehlers-Danlos, Syndrome d'

Biomécanique

Collagène

Imagerie

Mots clés libres

Microscopie non-linéaire

Tissus biologiques

Biophotonique

Fibrillogénèse

Optique non-linéaire

Résumé

Le collagène est une protéine ubiquitaire qui joue un rôle central dans l'architecture et la tenue mécanique des tissus conjonctifs et est impliqué dans de nombreuses pathologies. Synthétisé sous forme de triples hélices, le collagène s'auto-assemble en fibrilles in vivo et in vitro pour former des réseaux tridimensionnels. La microscopie multiphoton basée sur la génération de seconde harmonique (SHG) est une technique très spécifique, permettant de visualiser, sans marquage, le collagène en profondeur dans des tissus, avec une résolution sub-micrométrique. Ce travail de thèse vise à développer des approches quantitatives en imagerie SHG du collagène, tant à l'échelle fibrillaire que tissulaire. Nous avons montré que la microscopie SHG permet de sonder la dynamique de formation du réseau collagénique jusqu'à l'échelle d'une fibrille unique. En outre, nous avons caractérisé la structuration de gels collagéniques contrôlée par ajout de nanoparticules de silice fonctionnalisées. Nous avons ensuite réalisé de l'imagerie corrélative électronique/SHG sur ces gels pour mesurer la sensibilité de notre microscope et calibrer la réponse d'une fibrille en fonction de son diamètre. De plus, nous avons pu évaluer l'hyperpolarisabilité d'une molécule et valider le modèle additif utilisé pour calculer la réponse d'une fibrille. Enfin, nous avons développé une analyse d'images spécifique permettant de quantifier l'organisation d'un tissu collagénique à l'échelle fibrillaire, dans le but d'explorer la relation fonction/structure d'un tissu. Ceci a été validé en étudiant la modification des propriétés biomécaniques de souris génétiquement modifiées modèle du syndrome d'Ehlers-Danlos.

Collagen is an ubiquitous protein which plays a central role in the architecture and the mechanical integrity of connective tissues. Synthesized as triple helices, collagen self-assembles into fibrils both in vivo and in vitro to form three-dimensional networks. It is essential to probe this fibrillar organization to characterize tissu remodeling involved in many diseases and guide tissue engineering. Multiphoton microscopy based on second harmonic generation (SHG) is a very specific technique to visualize unstained collagen deep into tissues, with sub-micron resolution. This thesis aims to develop quantitative approaches in SHG imaging of collagen, at both fibrillar and tissular scales. We first showed that SHG microscopy is a relevant tool to measure the dynamics of formation of collagen networks, even at single fibril scale. We also characterized the structure of collagen gels controlled by adding functionalized silica nanoparticles. We then performed correlative electron/SHG imaging on these fibrillar gels. This allowed us to measure the sensitivity of our set-up and to calibrate the response of an isolated fibril as a function of its diameter. In addition, we derived the hyperpolarizability of a triple helix, which validated the additive model used to calculate the nonlinear response of a fibril. Concurrently, we developed specific image analysis to phenomenogically quantify the organization of the fibrillar network at micrometer scale with the view investigate the function/structure relationship in biological tissues. This was validated by characterizing the changes of biomechanical properties in genetically modified mice model of Ehlers-Danlos syndrome.