Etude de la diversité bactérienne et génétique dans des cultures dégradant l'ETBE ou le MTBE

• Auteur / Autrice : Yoann Le Digabel
• Direction : Timothy Vogel, Sandrine Demanèche
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie environnementale
• Date : Soutenance le 04/10/2013
• Etablissement(s) : Ecully, Ecole centrale de Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Électronique, électrotechnique, automatique (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Institut français du pétrole Énergies nouvelles (Rueil-Malmaison, Hauts-de-Seine)
• Jury : Président / Présidente : Pascal Simonet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Françoise Fayolle-Guichard, Théodore Bouchez
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pascale Bauda, Charles W. Greer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Écologie microbienne

Méthyl tertio butyl éther

Biotechnologie appliquée à l'environnement

Mots clés libres

ETBE (ethyl tert-butyl éther)

MTBE (méthyl tert-butyl éther)

Enrichissements

Biodégradation

Écologie microbienne

Gènes de dégradation

RISA

DGGE

QPCR

RT-qPCR

ETBE (ethyl tert-butyl ether)

MTBE (methyl tert-butyl ether)

Biodegradation capacities

Microbial ecology

Biodegradation genes

RISA

DGGE

QPCR

RT-qPCR

Résumé

L’éthyl tert-butyl éther (ETBE) et le méthyl tert-butyl éther (MTBE) sont des éthers carburants utilisés comme additifs dans les essences sans plomb. Du fait de leur utilisation massive, de nombreux cas de pollutions d’aquifères ont été répertoriés, en particulier pour le MTBE, et ces composés représentent donc un risque sanitaire potentiel. Des travaux récents ont permis de mettre en évidence différents micro-organismes capables de dégrader ces composés malgré leur faible biodégradabilité dans l'environnement. Néanmoins, une meilleure compréhension de l'écologie et de la régulation de ces capacités de dégradation permettrait une meilleure gestion de la bioremédiation de sites contaminés par l'ETBE ou le MTBE.L’objectif de la thèse, réalisée dans le cadre d'un projet ANR Blanc (MiOxyFun), est de mieux comprendre l'écologie des communautés microbiennes impliquées dans la dégradation de ces éthers et leur relation avec la régulation ainsi qu'avec les cinétiques de dégradation de ces composés par des membres spécifiques de ces communautés. Ainsi, à partir de différents échantillons environnementaux venant de sites pollués par l'ETBE ou le MTBE, des enrichissements ont pu être réalisés en laboratoire afin d'étudier leurs microflores. Ces enrichissements ont été étudiés notamment pour leurs cinétiques de dégradation, la composition de leurs communautés bactériennes, et pour l'isolement de souches bactériennes directement impliquées dans la dégradation de ces composés. L'étude des cinétiques de dégradation de l'ETBE ou du MTBE par différents enrichissements obtenus sur ETBE (cinq) et sur MTBE (six) a permis de montrer des profils de dégradation très différents. La dégradation était généralement lente et s'accompagnait d'un faible rendement en biomasse avec parfois accumulation transitoire de tert-butanol (TBA). Les capacités de dégradation d'autres composés des essences (BTEXs et n-alcanes) étaient aussi différentes d'un enrichissement à l'autre, le benzène, entre autres, étant dégradé par 10/11 enrichissements. Des techniques d'empreinte moléculaire (RISA, DGGE) ont permis de constater que les communautés bactériennes présentes dans les cinq enrichissements sur ETBE étaient différentes de celles sur les enrichissements sur MTBE. Les enrichissements sur ETBE ont fait spécifiquement l'objet d'une étude par analyse de banques de clones réalisées à partir des gènes codant l'ARNr 16S de ces enrichissements. Cette étude a montré la prédominance des Proteobacteria dans trois enrichissements, la prédominance des Acidobacteria dans un autre ainsi qu'une composition plus héterogène dans le cinquième. De plus, des Actinobacteria ont été détectées dans les 5 enrichissements.En parallèle, plusieurs souches possédant des capacités de dégradation ont été isolées des enrichissements: Rhodococcus sp. IFP 2040, IFP 2041, IFP 2042, IFP 2043 (dégradant l'ETBE jusqu'au TBA), une Betaproteobacteria IFP 2047 (dégradant l'ETBE), Bradyrhizobium sp. IFP 2049 (dégradant le TBA), Pseudonocardia sp. IFP 2050 (dégradant l'ETBE et le MTBE), Pseudoxanthomonas sp. IFP 2051 et une Proteobacteria IFP 2052 (dégradant le MTBE). Une étude par qPCR sur les gènes codant l'ARNr 16S a montré la prédominance de certaines souches isolées dans les enrichissements ETBE. Enfin, plusieurs gènes connus comme étant impliqués dans la dégradation des éthers carburants ont pu être mis en évidence dans les enrichissements et dans certaines des souches isolées.

ETBE and MTBE are fuel oxygenates added to unleaded gasoline to improve combustion. Due to their extensive use, numerous aquifers have been contaminated, particularly by MTBE. The use of ETBE and MTBE is considered to represent an environmental risk. Recent research has uncovered a range of microorganisms capable of degrading these compounds, even though their environmental half-lives are long. Improved understanding of the ecology and regulation of this degradative ability could improve the management of the ETBE and MTBE contaminated site remediation. The aim of this work, taking place in the framework of the ANR project MiOxyFun was to investigate the ecology of ETBE- and MTBE-degrading microbial communities and their relationship to the regulation and kinetics of ETBE- and MTBE-degradation by specific members of these communities. Several ETBE- and MTBE-degrading microbial communities were enriched in the laboratory from environmental samples from contaminated sites throughout the world. These enrichments were examined for their degradation kinetics, microbial community structure, and used to isolate specific community members actively degrading ETBE and/or MTBE. The ETBE or MTBE biodegradation kinetics of the five ETBE- and six MTBE- degrading enrichments demonstrated a diversity of biodegradation rates. Overall, biodegradation was generally slow and associated to a low biomass yield. Tert-butanol (TBA) was transiently produced in several cases. Biodegradation of other gasoline compounds (BTEXs and n-alkanes) was tested and varied among the enrichments studied. Benzene, however, was degraded in 10 out of the 11 enrichments. DNA fingerprinting techniques (RISA, DGGE) showed that the microflora present in the five ETBE enrichments were different from those of the MTBE enrichments. The ETBE enrichments were studied further by sequencing the 16S rRNA genes extracted, amplified and cloned from these enrichments. Proteobacteria dominated three of the ETBE enrichments, Acidobacteria in another one, and a more heterogeneous composition was found in the fifth ETBE enrichment. Actinobacteria were detected in all five enrichments. Several strains with ETBE or MTBE degradation capacities were isolated: Rhodococcus sp. IFP 2040, IFP 2041, IFP 2042, IFP 2043 (degrading ETBE to TBA),a Betaproteobacteria IFP 2047 (degrading ETBE), Bradyrhizobium sp. IFP 2047 (degrading TBA), Pseudonocardia sp. IFP 2050 (degrading ETBE and MTBE), Pseudoxanthomonas sp. IFP 2051 and a Proteobacteria IFP 2052 (degrading MTBE). Quantification of the 16S rRNA gene confirmed the relatively high number of these isolates in some of the ETBE enrichments. Several genes involved in ETBE and/or MTBE biodegradation were detected in some of the enrichments and in some of the isolated strains.