Synthèse et évaluation de dérivés d'anhydride isatoïque pour l'acylation sélective des ARNs : application à la séparation des acides nucléiques

par Sylvain Ursuegui

Thèse de doctorat en Pharmacochimie et modélisation moléculaire

Sous la direction de Frédéric Fabis.

Soutenue en 2013

à Caen .

mots clés

• ARN -- Thèses et écrits académiques
• Anhydride isatoïque -- Thèses et écrits académiques
• Acylation -- Thèses et écrits académiques
• Acides nucléiques -- Séparation -- Thèses et écrits académiques

Résumé

Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été consacrés au développement d’une nouvelle méthode de séparation des acides nucléiques basée sur une acylation sélective des groupements 2’-hydroxyles de l’ARN permettant de discriminer chimiquement l’ADN de l’ARN. Des dérivés d’anhydride isatoïque, comprenant une biotine et un linker chemolabile (pont disulfure), ont été spécifiquement conçus pour cette application. L’ARN est tout d’abord sélectivement acylé par attaque nucléophile des groupements 2’-hydroxyles sur l’anhydride isatoïque. Les acides nucléiques ainsi biotinylés sont alors capturés par des billes magnétiques fonctionnalisées par des streptavidines puis relargués par clivage du pont disulfure. Des dérivés d’anhydride 8-aza et 7-carboxyisatoïques ont été synthétisés durant la première partie des travaux. Ces composés ont permis de réaliser l’étape clé de fonctionnalisation de l’ARN à température ambiante et ainsi d’obtenir une grande sélectivité du procédé de séparation. Néanmoins, les ARNs extraits par cette méthode sont élués avec des résidus anthranylates issus de l’acylation. Ces résidus peuvent potentiellement inhiber les processus d’amplification comme la RT-PCR. Pour s’affranchir de cette limitation, des dérivés d’anhydride isatoïque auto-immolables ont été développés au cours de la seconde partie de ces travaux. Ainsi, par un système de cyclisation intra-moléculaire conduisant à la formation d’une thiolactone stable, une méthode de clivage biocompatible du lien anthranylate a été mise en place. La synthèse de dérivés azaisatoïques auto-immolables a alors été réalisée et ces composés ont été testés avec succès pour l’acylation et le relargage d’ARN sans résidu de fonctionnalisation.

Titre traduit

Synthesis and evaluation of isatoic anhydride derivatives for selective RNA acylation : application to nucleic acid separation

Résumé

This project aimed at developing an innovative nucleic acids separation method based on a selective 2’-hydroxyl acylation of RNA in order to discriminate DNA and RNA. Isatoic anhydride derivatives, including a biotin and a chemolabile linker (disulfide bond) were specifically designed for this application. First, RNA is selectively acylated by the nucleophilic addition of the 2’-OH groups of RNAs on the carbonyl group of isatoic anhydride. The biotinylated nucleic acids are captured by magnetic beads coated with streptavidin and eluted after disulfide chemical cleavage. 8-aza and 7-carboxyisatoic anhydride derivatives were synthesized during the first part of this work. These compounds allowed to tag RNA at room temperature, increasing the selectivity of the separation process. However, RNA strands extracted by this method were eluted with 2’-OH adducts that could inhibit amplification process like RT-PCR. To overcome this limitation, self immolative isatoic anhydride derivatives have been studied in the second part of this work. Through an intramolecular cyclisation system leading to the formation of a stable thiolactone, a biocompatible cleavage of anthranilic bond was developed. Self-immolative azaisatoic anhydride derivatives were synthesized and successfully used for the acylation and release of RNA free of any adduct from the functionalization step.