Caractérisation morphotypique et génotypique de Lactobacillus rhamnosus CNCM-I-3698 et de Lactobacillus farciminis CNCM-I-3699 et de ses deux variants en relation avec les propriétés de surface et les propriétés probiotiques

par Raouf Tareb

Thèse de doctorat en Physiologie, biologie des organismes et populations

Sous la direction de Jean-Paul Vernoux.

Soutenue en 2013

à Caen .

mots clés

• Lactobacilles
• Probiotiques
• Génomique
• Campylobacter

Résumé

Les 2 lactobacilles L. Rhamnosus CNCM I-3698 et L. Farciminis CNCM I-3699 sont des additifs commercialisés par l’entreprise DuPont-Danisco en nourriture animale en raison de leurs propriétés probiotiques et zootechniques. Nous avons démontré ici leurs propriétés d’agrégation et de coagrégation à l’état vivant ou tués par la chaleur, ainsi que leur fort potentiel bioprotecteur in vitro à l’encontre de pathogènes digestifs tels qu’Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. , Brachyspira spp. Ou encore Campylobacter jejuni. C’est ce dernier pathogène qui a été choisi comme espèce cible modèle car c’est un pathogène zoonotique du porc qui a un fort impact en épidémiologie humaine en Europe. Pour comprendre ces interactions in vitro qui semblent spécifiques à nos lactobacilles bien qu’ils appartiennent à 2 espèces différentes, la caractérisation de leurs composés de surface a été entreprise. Au niveau de l’analyse du morphotype, cela a permis la découverte et l’isolement de 2 variants naturels morphotypiques R pour Rough (agrégeant, non ropy) et S pour Smooth (non agrégeant, ropy) à partir de la souche mère, ainsi confirmée pléïomorphe, L. Farciminis CNCM-I-3699. Le typage moléculaire n’a montré aucune différence que ce soit par PFGE, ARN 16 S ou CRISPR. Les analyses IRTF et microscopiques ont confirmé que le caractère ropy était associé à la présence d’exopolysaccharides (EPS) capsulaires et que le caractère agrégeant était associé à des transconformations de protéines de surface vers des structures riches en feuillets β (β-sheet). Les analyses génomiques ont révélé que le draft genome de L. Rhamnosus CNCM-I-3698 contient 2 978 531 bases avec un G+C de 46. 68%. L’analyse in silico montre qu’il est proche des souches de l’industrie laitière et qu’il est particulièrement adapté à l’environnement intestinal via la présence d’une grande variété de protéines de surface impliquées dans l’agrégation cellulaire, dans la formation de biofilm ainsi que dans l’adhérence au mucus. La présence de deux alpha-L-fucosidases et d’une alpha-mannosidase est une originalité probiotique car elles permettent la digestion des oligosaccharides fucosylés. Pour L. Farciminis CNCM-I-3699 les études génomiques montrent que les drafts génomes de ses 2 variants contiennent 2,431,343 avec 35, 79% de G+C pour R et 2,511,481 bp avec 36, 25% de G+C pour S. Une endoglucanase impliquée dans la digestion de la cellulose, est identifiée. Le variant Smooth contient à lui seul en plus, une région spécifique de 34,926 pb qui contient un locus pour les EPS capsulaires, des gènes impliqués dans la respiration anaérobie et aussi des transporteurs de sucres ainsi qu’une enzyme spécifique comme l’Alpha-glucosidase très utiles pour l’hydrolyse du sucrose, du maltose et du trehalose. Les applications immédiates de ces découvertes génotypiques ont été la mise au point de plusieurs sets d’amorces propres aux deux lactobacilles pour leur dosage spécifique sur matrice complexe ainsi que la confirmation de la localisation intrinsèque des diverses résistances aux antibiotiques constatées pour chacune des souches. L’utlisation des larves de Galleria mellonella comme modèle toxicologique d’infection in vivo par C. Jejuni a été confirmé et un fort effet préventif de nos deux souches de lactobacilles (mortes ou vivantes) préincubées avec le pathogène a été constaté contrairement aux autres lactobacilles testés. En conclusion nos lactobacilles sont bien des lactobacilles probiotiques et il y a bien un tropisme fort pour C. Jejuni qui s’explique par les propriétés des molécules de surface retrouvées par analyse «in silico», propriétés conservées aussi après action de la chaleur. L’influence de l’environnement reste aussi primordiale pour comprendre la vie et le comportement de ces bactéries probiotiques.

Titre traduit

Phenotypic and genotypic characterisation of Lactobacillus rhamnosus CNCM I- 3698 and of Lactobacillus farciminis CNCM I- 3699 and its two variants R and S, in relation to cell surface and probiotic properties

Résumé

The 2 lactobacilli L. Rhamnosus CNCM-I-3698 and L. Farciminis CNCM-I-3699 are commercial additives from DuPont-Danisco used in feed because of their probiotic and zootechnical properties. Here, we demostrated aggregation and coaggregation properties (for live or heat-killed cells), along with their high bioprotective potential in vitro against pathogen of the intestine as Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. , Brachyspira spp or Campylobacter jejuni. This latter pathogen was choiced as target species since it is a zoonotic pathogen of pig having a high impact in human epidemiology in Europe. To understand these in vitro interactions which seem specific to our lactobacilli, although they belong to 2 different species, characterisation of their cell-surface compounds was undertaken. At morphotypic analysis level, we have discovered and isolated 2 natural variants R for Rough (aggregative, non ropy) and S pour Smooth (non aggregative, ropy) from the mother strain L. Farciminis CNCM-I-3699, thus showed as pleomorphic. Molecular typing had not shown differences using PFGE, or ARN 16 S or CRISPR analytical technics. Microscopic or IRTF analysis confirmed that Ropy character was associated to capsular exopolysaccharides (EPS) and that the aggregative character was associated to cell-surface protein transconformations towards rich β-sheet structures. Genome analysis gave the draft genome of L. Rhamnosus CNCM-I-3698. It contains 2 978 531 base pairs with a 46. 68% G+C content. In silico analysis identified the presence of genes encoding proteins for a variety of cell surface proteins involved in cell aggregation, biofilm formation and mucus adherence, which may play an important role in colonization of Gastrointestinal Tract. Presence of 2 alpha-L-fucosidases and 1 alpha-mannosidase was an original nutitional point for digestion of some special oligosaccharide such as fucosyled oligosaccharide. L. Farciminis CNCM-I-3699 genome contains 2,431,343 with G+C content of 35, 79% for R variant and 2,511,481 bp with G+C content of 36, 25% for S variant. An endoglucanase, useful for cellulose digestion, was identified. The Smooth form is alone to contain an additive specific domain of 34,926 pb to sustain its growth in rich environmental anaerobic niches and which harbour Capsular polysaccharide loci, genes implicated in anaerobic respiration and also sugar transporter and enzyme such as Alpha-glucosidase which is important for hydrolyze of sucrose, maltose and trehalose. Transfer of this new knowledge acquired in this Ph D study was possible with the designing of some sets of primers specific for L. Rhamnosus CNCM-I-3698 and L. Farciminis CNCM-I-3699 in view of their specific dosage on complex matrix. It allows aso to confirm intrinsic genome localisation of diverse antibiotic resistances shoown with each strain L. Rhamnosus CNCM-I-3698 or L. Farciminis CNCM-I-3699. The use of larvae of Galleria mellonella as toxicological model for studying in vivo infection by C. Jejuni was confirmed and a high preventive effect of our two strain or variants (heat-killed or live) preincubated with the pathogen was stated but not for the other lactobacilli tested. In conclusion these two lactobacilli are probiotic lactobacilli which have a high tropism for C. Jejuni which can be explained by properties of specific cell-surface molecules found by «in silico» analysis, proprerties which were also kept after heat-killing of cells. Environmental conditions are also essential to understand life and behaviour of these probiotic bacteria.