Criblage de souches bactériennes productrices de polyhydroxyalcanoates (PHA) et caractérisation moléculaire des polyesters selon la source de carbone : Etude de la conversion du glycérol en mcl-PHA par Bacillus megaterium DSM 509 en bioréacteur batch et batch alimenté

par Salma Shahid

Thèse de doctorat en Biotechnologie, agroalimentaire

Sous la direction de Jean-Luc Gaillard.

Soutenue en 2013

à Caen .

mots clés

• Chromatographie en phase gazeuse -- Thèses et écrits académiques
• Fourier, Spectroscopie infrarouge à transformée de -- Thèses et écrits académiques
• Résonance magnétique nucléaire -- Thèses et écrits académiques
• Fermentation -- Thèses et écrits académiques
• Bioréacteurs -- Thèses et écrits académiques
• Pseudomonas -- Thèses et écrits académiques
• Microorganismes -- Croissance -- Thèses et écrits académiques
• Métabolisme -- Thèses et écrits académiques

Résumé

Polyhydroxyalkanoates (PHA) are biodegradable bioplastics produced by a wide variety of bacteria. Unlike scl-PHA, the industrial development of the attractive mcl-PHA is still limited. In this context, 22 bacteria were investigated for synthesis of original mcl-PHA from different carbon sources with various nitrogen conditions. Preliminary experiments with glucose resulted in the selection of 4 PHA producers using FTIR spectroscopy. These strains (Pseudomonas putida mt-2, Bacillus megaterium DSM 90 and 509, Corynebacterium glutamicum DSM 20137) were further tested with 8 additional carbon substrates. Their PHA content and monomer composition were assessed by GC-FID, GC-MS and NMR during growth on a mineral medium (MM) and after transfer on a fresh MM without nitrogen (MM-N). For several carbon substrates, substantial amounts of PHA (53% of CDW) were already obtained in MM for C. Glutamicum and the 2 B. Megaterium strains; after transfer in MM-N, PHA contents remained constant except for B. Megaterium DSM 509 where PHA production increased whatever the carbon source. Highest PHA accumulation reached 53-77% of CDW with glycerol and octanoic acid. According to nitrogen availability, an atypical PHA metabolism related to structurally unrelated carbon sources was demonstrated in B. Megaterium DSM 509 which produced scl and/or mcl-PHA. Effects of glycerol and nitrogen on PHA synthesis were further investigated with this last strain by mean of a reduced centred experimental design. PLS processing was successfully applied to the data and showed that C/N ratio ≤ 5 promoted cell growth whereas higher ratio combined to O2 limitation favoured PHA production. These conditions were tested on both sequential and continuous fed-batch cultures. The yield mcl-PHA/glycerol (0. 54 g. G-1) and the final PHA concentration (4. 9 g. L-1) were slightly higher in continuous fed-batch.

Titre traduit

Screening of bacterial strains producing polyhydroxyalkanoates (PHA) and molecular characterization of the polyesters in relation to the carbon source : Study of the glycerol conversion into mcl-PHA by Bacillus megaterium DSM 509 in batch and fed-batch bioreactor

Résumé

Les polyhydroxyalcanoates (PHA) sont des bioplastiques biodégradables produits par diverses bactéries. Contrairement aux scl-PHA, le développement industriel des mcl-PHA est encore limité. Dans ce contexte, la synthèse de mcl-PHA a été étudiée chez 22 bactéries à partir de différentes sources de carbone et de conditions azotées. Des expériences préliminaires sur glucose ont abouti, après analyse spectroscopique IRTF, à la sélection de 4 producteurs de PHA. Ces souches (Pseudomonas putida mt-2, Bacillus megaterium DSM 90 et 509, Corynebacterium glutamicum DSM 20137) ont été testées sur 8 substrats carbonés supplémentaires. Les compositions monomériques et les teneurs en PHA ont été évaluées par GC-FID, GC-MS et RMN après croissance sur milieu minéral (MM) puis transfert sur MM frais exempt d’azote (MM-N). Pour plusieurs substrats, d’importantes quantités de PHA (53% de la MS) étaient déjà obtenues sur MM chez C. Glutamicum et les 2 souches de B. Megaterium ; après transfert sur MM-N, les niveaux de PHA restaient constants à l'exception de B. Megaterium DSM 509 où la production augmentait quelle que soit la source de carbone. Les teneurs finales en PHA atteignaient 53-77% de la MS sur glycérol et acide octanoïque. Un métabolisme PHA atypique lié à la disponibilité azotée et à la nature chimique des sources de carbone a été démontré chez B. Megaterium DSM 509 qui produisait des scl et/ou des mcl-PHA. Les effets du glycérol et de l'azote sur la synthèse de PHA ont été étudiés sur cette dernière souche au moyen d’un plan expérimental centré réduit. Un traitement PLS, appliqué avec succès aux données, montrait qu’un ratio C/N ≤ 5 favorisait la croissance cellulaire alors qu’un ratio supérieur combiné à une limitation en O2 augmentait la production de PHA. Ces conditions ont été testées en cultures batch alimentées séquentielle et continue. Le rendement en mcl-PHA/glycérol (0,54 g. G-1) et la teneur finale en PHA (4,9 g. L-1) étaient légèrement plus élevés en batch alimenté continu.