Etude de la signalisation calcique du lymphocyte B en pathologie

par Tinhinane Fali

Thèse de doctorat en Biologie et santé. Immunologie

Sous la direction de Yves Renaudineau.

Le président du jury était Marie-Christine Béné.

Le jury était composé de Yves Renaudineau, Marie-Christine Béné, Moncef Zouali, Olivier Mignen, Alain Saraux, Wesley H. Brooks.

Les rapporteurs étaient Marie-Christine Béné, Moncef Zouali.


  • Résumé

    La signalisation calcique est un mécanisme physiologique essentiel pour l’homéostasie cellulaire, et en particulier pour les cellules immunitaires telles que les lymphocytes B (LB). Chez l’homme, la caractérisation des molécules impliquées dans la signalisation calcique des LB est encore restreinte. Nous avons donc choisi d’étudier les molécules STIM1, STIM2, Orai1 et TRPC1 afin de rendre compte des modifications de la signalisation calcique observées dans deux modèles physiopathologiques : le Lupus Erythémateux Systémique (LES) et la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC). Pour les LB de LES, par rapport à des LB de témoins, ce travail a permis de montrer que la surexpression de la molécule STIM1 dans les LB de LES, surtout au stade des LB transitionnels, était associée avec un influx constitutif et extracellulaire de calcium et que cet influx était responsable d’une phosphorylation modérée de la MAPK Erk1/2 dans les cellules au repos. Cependant, cet effet positif est contrebalancé par un défaut de l’influx SOCE (strore operated calcium entry) et d’un défaut d’activation de la phosphorylation de la MAPK Erk après stimulation du récepteur à l’antigène des LB (BCR). Les effets positifs et négatifs observés sur la phosphorylation d.Erk1/2 sont directement attribuables au niveau d’expression de STIM1 comme nous l’avons démontré en sur-exprimant STIM1 dans des LB de témoins (vecteur pSTIM1-STIM1) ou en ayant recours à un siRNA spécifique de STIM1 dans les LB de LES. Le défaut d’activité régulatrice des LB de LES sur la prolifération des LT dans un modèle de co-culture autologue LT/LB en présence de CpG (activation du TLR9 des LB), et d’anticorps anti-CD3/CD28 (activation des LT) est levé en inhibant l’expression de STIM1 dans ces cellules ce qui permet de restaurer la production d.IL-10 par les LB de LES et la génération de LT régulateurs. Le défaut d’activation de la voie Erk/DNMT1/méthylation de l’ADN dans les LB de LES semble également contrôlée par le niveau d’expression de la molécule STIM1.Pour les LB CD5+ de LLC, l’analyse des partenaires calciques nous a permis de distinguer deux groupes de patients : un premier groupe qui exprime le complexe membranaire STIM1/TRPC1/Orai1 et un second groupe qui n’exprime qu’Orai1. La présence du complexe membranaire STIM1/TRPC1/Orai1 est associée avec un influx constitutif de calcium, la phosphorylation d’Erk1/2, et un défaut d’activation du signal SOCE après stimulation du BCR. Le rôle de la molécule CD5 sur l’influx constitutif des LLC du groupe I a été démontré en utilisant des siRNA spécifiques pourCD5 et en analysant la lignée B humaine Jok-1 transfectée avec CD5. Enfin, l’utilisation d’un anticorps anti-STIM1 est capable d’induire l’apoptose in vitro des LB de LLC du groupe I, alors que l’anticorps anti-CD20, rituximab, n’est efficace que sur les LLC du groupe II.En conclusion, cette étude ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques en auto-immunité dans le LES et en cancérologie dans la LLC.

  • Titre traduit

    No


  • Résumé

    Calcium signaling is a central mechanism for cellular homeostasis, including for immune cells such as B lymphocytes (B cells). In human, the characterization of the molecules involved in B cell calcium signalisation is still limited and we have focused our study on STIM1, STIM2, Orai1 and TRPC1. In order to better understanding the role of these molecules, two pathologies, with known calcium dysregulations, were chosen : Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).For SLE B cells, compared to healthy control (HC) B cells, this work has established that overexpression of the STIM1 molecule characterizes SLE B cells, especially at the transitional B cell stage. STIM1 overexpression in SLE B cells was associated with a constitutive extracellular calcium influx that in turn contributes to the moderate phosphorylation of the MAPK Erk1/2. However, this positive effect is counterbalanced by a defective strore operated calcium entry (SOCE), and a defective Erk phosphorylation after B cell receptor (BCR) activation. The positive and negative effects on the MAPK Erk1/2 in SLE B cells are directly linked to level of STIM1 as demonstrated in HC B cells transfected with a STIM1 vector (pSTIM1-STIM1), or by using a specific siRNA to STIM1 (siSTIM1) in SLE B cells.The incapacity of SLE B cells to regulate T cell proliferation in an autologous co-culture T/B cell model is reversed by using siSTIM1 in SLE B cells. In this model, using siSTIM1 in SLE B cells also restores the production of IL-10 by B cells, and the generation of regulatory T cells. The defective Erk/DNMT1/DNA methylation pathway in SLE B cells is suspected to be under the control of STIM1 overexpression.For CD5+ CLL B cells, analysis of calcium partners has enabled us to distinguish two groups of patients: one group that expresses at the plasma membrane the complex STIM1/TRPC1/Orai1 and a second group that expresses onlyOrai1. The presence of the membrane complex STIM1/TRPC1/Orai1 in CLL group I is associated with a constitutive extracellular calcium influx, the basal phosphorylation of Erk1/2, and a defaut to mobilize SOCE upon BCR engagement. In the CLL group I patients, a role of CD5 on the constitutive extracellular calcium influx was shown using siRNA specific to CD5 and using the transfected CD5 expressing B cell line Jok-1. Finally, the in vitro use of an anti-STIM1 antibody is able to induce apoptosis in CLL B cells from group I patients, while the anti-CD20 antibody (rituxan) was only effective in the CLL B cells from group II patients.In conclusion, this study opens new diagnostic and therapeutic perspectives in autoimmunity and in cancer.



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