Activité carbapénémase des β-lactamases de type AmpC

par Hélène Guillon

Thèse de doctorat en Biologie santé. Bactériologie

Sous la direction de Hedi Mammeri.

Soutenue en 2013

à Amiens .

mots clés

• Carbapénèmes -- Thèses et écrits académiques
• β-lactamases -- Thèses et écrits académiques
• Résistance aux antibiotiques -- Thèses et écrits académiques
• Escherichia coli -- Thèses et écrits académiques
• Entérobactéries -- Thèses et écrits académiques
• Cephalosporinase -- Dissertations universitaires

Résumé

Les β-lactamases de type AmpC (céphalosporinases) semblent fréquemment responsables de la résistance aux carbapénèmes chez les entérobactéries, ce que permettent d’évoquer de nombreuses descriptions cliniques. L’objectif de cette thèse était d’effectuer une caractérisation phénotypique, biochimique et moléculaire de l’activité carbapénémase des AmpC. Tout d’abord, les gènes des cinq principales céphalosporinases plasmidiques ont été clonés puis transformés dans la souche imperméable Escherichia coli HB4. Les comparaisons phénotypiques et structurales des clones recombinants ont montré que les céphalosporinases CMY-2, ACT-1, et DHA-1 se distinguent des autres enzymes par leur capacité à conférer une résistance aux carbapénèmes et par la présence d’une asparagine en position 346 (Asn 346), située à proximité du site catalytique. Des expériences de mutagénèse dirigée, consistant à substituer l'Asn 346 par des résidus de taille, de charge et de polarité différentes dans la céphalosporinase CMY-2, ont démontré le rôle de cet acide aminé dans l’activité carbapénémase des céphalosporinases. La caractérisation biochimique de trois variants a révélé que l'Asn 346 contribue à l’affinité de CMY-2 pour l'imipénème. L'étude de l’activité carbapénémase des AmpC chromosomiques à spectre étendu (ACSE) a constitué le second volet de la thèse. Le séquençage, le clonage et la caractérisation biochimique d'une nouvelle ACSE produite par une souche clinique de E. Coli résistante à l'ertapénème ont démontré que l'extension du spectre d'hydrolyse des céphalosporinases, qui est due à une augmentation de leur affinité, peut être aussi responsable d'une résistance aux carbapénèmes.

Titre traduit

Carbapenemase activity of AmpC-type bêta-lactamases

Résumé

Owing to several clinical reports, it appears that AmpC-type β-lactamases (cephalosporinases) account frequently for carbapenem resistance in Enterobacteriaceae. The aim of this study was to perform a phenotypic, biochemical, and molecular characterization of the carbapenem-hydrolyzing activity of AmpC-type β-lactamases. First of all, the genes encoding the five main plasmid-mediated AmpC β-lactamases were cloned and transferred into the porin-deficient Escherichia coli HB4 strain. Phenotypic and molecular comparison of the recombinant strains revealed that only CMY-2, ACT-1, and DHA-1 conferred resistance to carbapenems and had an asparagine residue at position 346 (Asn 346), located in the vicinity of the active site. Site-directed mutagenesis experiments were performed to replace the Asn 346 residue of CMY-2 β-lactamase by amino acids differing in size, charge, and polarity. It confirmed the contribution of Asn 346 to the carbapenem-hydrolysing activity of cephalosporinases. Biochemical characterization of three variants revealed that Asn 346 assisted the binding of imipenem. The analysis of the carbapenem-hydrolyzing activity of chromosomal extended-spectrum AmpC β-lactamases (ESAC) constitutes the second part of this thesis. Sequencing, cloning and biochemical characterization of a novel ESAC produced by an ertapenem-resistant E. Coli clinical isolate demonstrated that the extension of the hydrolysis spectrum of cephalosporinases, which was due to increased affinity, may also contribute to carbapenem resistance.