Caractérisation des substances polymériques extracellulaires de boues granulaires aérobies : propriétés chimiques et implication dans la cohésion du granule

par Cédric Caudan

Thèse de doctorat en Ingénieries microbienne et enzymatique

Sous la direction de Elisabeth Girbal et de Mathieu Sperandio.

Soutenue en 2012

à Toulouse 3 .

mots clés

• Substances Exopolymériques
• Granules
• Protéines anioniques
• Polysaccharides
• Cohésion
• Eaux usées -- Épuration
• Boues d'épuration

Résumé

Depuis une dizaine d'années, les procédés utilisant des boues granulaires aérobies pour le traitement des effluents ont fait l'objet de nombreuses recherches. Alors que les conditions opératoires conduisant à l'obtention d'agrégats microbiens denses ont pu être définies, peu d'éléments ont été rapportés quant aux mécanismes biologiques favorisant la formation et la stabilité des granules. Diverses études suggèrent toutefois l'implication des Substances Polymériques Extracellulaires (EPS), composés majeurs de la matrice extracellulaire, sur les propriétés physico-chimiques des granules formés (densité, cohésion). Afin de répondre à cette question, une double approche a été menée, basée d'une part sur l'analyse des propriétés chimiques des EPS extraits de granules, et d'autre part sur des mesures de cohésion réalisées après digestion enzymatique ou chimique des granules en vue d'altérer la matrice d'EPS. Un procédé d'extraction multi-méthodes incluant des traitements physiques (ultrasons) et chimiques (détergent, chélateur de cations) a été mis au point afin d'extraire les EPS de granules produits en réacteur pilote de type SBR et impliqués dans un procédé aérobie de transformation de l'azote. L'analyse des EPS extraites confirme l'intêret de ce protocole tant d'un point de vue de son efficacité (épuisement des EPS après 3 séquences) que de sa capacité à fractionner les EPS en ciblant des natures biochimiques (protéines, sucres) et/ou fonctions chimiques (hydrophobicité, caractère anionique) différentes. Ainsi, la comparaison des profils d'extraction à ceux obtenus à partir d'agrégats peu denses (flocs) souligne dans le cas des EPS de granules, la prépondérance de protéines extractibles en présence d'un chélateur de cations. Une analyse par chromatographie anionique confirme la présence de protéines fortement chargées dont le caractère anionique est plus marqué que celui des EPS extraites de boues floculantes, suggérant le rôle potentiel des intéractions électrostatiques dans la cohésion des granules. Les granules prélevés ont par la suite été soumis à divers traitements de type enzymatiques (protéases ou de glycosidases) ou chimiques (EDTA ou NaCl) avant d'être soumis à un test de cohésion (application de containtes hydrodynamiques en cuve agitée). L'analyse des transferts de matière a montré que la digestion de protéines entrainait un relarguage important de matière organique colloïdale avec libération de calcium mais sans perte significative de cohésion. En contrepartie, la digestion des a (1-4) glucanes semble fragiliser la cohésion des granules car un détachement important de macroparticules (de tailles comprises entre 315 et 2820 µm) non associé à la libération de calcium a été observé après application de la contrainte hydrodynamique. Enfin, le traitement préalable des granules par l'EDTA en tant que chélateur de cations divalents, s'est traduit par une diminution de la taille des granules, un relarguage de calcium et une solubilisation de micro-particules (taille inférieure à 315 µm) entrainant une baisse significative de leur résistance au détachement. Ces expériences de pertubation de la cohésion des granules permettent donc de mettre en évidence des mécanismes divergents pour les différents composants de la matrice extracellulaire participant à la cohésion des granules. Elles soulignent en particulier le rôle prépondérant des alpha-glucanes dans le maintien de la cohésion ainsi que celui des protéines anioniques susceptibles de participer à l'aggrégation via des interactions électrostatiques impliquant le calcium. Enfin, l'observation des granules en microscopie confocale a confirmé le rôle complémentaire de ces polymères en montrant pour chacun d'eux une organisation structurale particulière: les alpha-glucanes étant préférentiellement organisés en guangues polysaccharidiques entourant les bactéries, elles-mêmes enchassées dans un réseau protéique dense.

Résumé

For ten years, methods using aerobic granular sludge process for wastewater treatment have been extensively studied. Although the operating conditions leading to the production of dense microbial aggregates have been defined, little evidence has been reported about the biological mechanisms promoting the formation and stability of granules. However, exopolymeric substances (EPS) are major components of the extracellular matrix and various studies have suggested their involvement of, in the physicochemical properties of the formed granules (density, cohesion). To answer this question, a dual approach was undertaken in this work, based partly on analysis of the chemical properties of the EPS extracted from granules, and also on measurement of the granule cohesion performed after enzymatic digestion or chemical treatment of the EPS matrix. A multi-methods extraction protocol including physical steps (ultrasound) and chemical steps (non-ionic detergent, cation chelating agent) was developed in order to extract EPS from granules cultured in a SBR pilot and performing aerobic nitrogen removal. Analysis of the extracted EPS has confirmed the efficacy (depletion of EPS after 3 sequences) and the ability of this multi-methods protocol for EPS fractionation according to their biochemical nature (proteins, polysaccharides) and / or chemical functions (hydrophobic, anionic character). Comparison of the extraction profiles obtained from dense granules with those obtained from low-density aggregates (flocs) pointed out the preponderance in granule EPS of extractable proteins in the presence of a cation chelating agent. Analysis by anion chromatography of the granule EPS extracts confirmed the presence of highly charged proteins showing stronger anionic character than that of proteins extracted from flocculent sludge, suggesting thus a potential role of electrostatic interactions in the cohesion of granules. The collected granules were subsequently subjected to various treatments including enzymatic digestions (proteases or glycosidases) or chemical actions (EDTA or NaCl). The cohesion of both native and treated granules was then assayed by application of a controlled hydrodynamic strain in a stirred tank. Analysis of mass transfer showed that protein digestion has provoqued colloidal organic matter release with simultaneous calcium discharge but the granule cohesion was not significantly altered. In return, the cohesion of granules was decreased after a (1-4) glucan digestion since important detachment of macroparticles (with sizes of between 315 and 2820 microns) was observed after application of the hydrodynamic stress. This macroparticular detachment was not associated with any calcium release. Finally, treatment of granules with the chelator EDTA has resulted in the decrease of the granule size, the solubilization of micro-particles (smaller than 315 microns) and important calcium release, leading to significant drop in the resistance of granules towards detachment. These experiments allow thus to highlight that granule cohesion is carried out through diverging mechanisms involving different components of the extracellular matrix. In particular, they point out the role of alpha-glucan in maintaining cohesion and that of anionic proteins in promoting aggregation through electrostatic interactions involving calcium. At last, observation of granules by confocal microscopy confirmed the complementary role of these polymers, showing, for each of them, a particular structural organization: the alpha-glucans appeared preferentially organized in polysaccharidic cuticules surrounding the bacteria themselves encircled by a dense protein network.