Caractérisation du génome de l'herpès simplex virus de type 1

par Charlotte Mahiet

Thèse de doctorat en Virologie

Sous la direction de Simon Wain-Hobson.

Soutenue en 2012

à Paris 7 .

mots clés

• Simplexvirus
• Herpèsvirus humain de type 1 -- génétique
• ADN viral
• Génome viral
• Désoxyribonucléases
• Recombinaison génétique

Résumé

HSV-1 est un virus affectant l'humain et qui communément provoque des lésions oraux-faciales récurrentes. Même s'il y a des thérapies efficaces qui bloquent la réplication du virus, il n'est jamais éradiquer de son hôte. Ainsi, Cellectis a pour objectif de développer les méganucleases qui clivent spécifiquement au niveau du génome viral. La question initiale posée durant cette thèse a été de déterminer comment prouver l'efficacité et la sûreté d'une telle thérapie. Pour cela, nous avons proposé d'utiliser la technologie de Peignage Moléculaire pour la visualisation directe et l'analyse de molécules uniques par l'hybridation de sondes spécifiques sur de l'ADN irréversiblement fixé et étiré. Nous avons été confrontés à la complexité du génome HSV-1. En effet, ce génome de 152 kb est organisé en deux fragments, composés de séquences uniques entourés de séquences inversées répétés. Par recombinaison homologue entre les séquences répétées, quatre isomers sont générés. Nous avons testé l'hypothèse que quelque soit les cellules infectées ou la souche utilisée, les quatre isomers étaient répartis de façon équivalente. L'analyse par peignage moléculaire a révélé des distributions statistiquement non équivalentes en fonction de la souche et des cellules analysées. Nous avons également détectés des concatemères de réplication aussi long que 10 génomes équivalents ; De façon intéressante, les isomers étaient systématiquement répartis de façon équivalente dans ces concatemères suggérant que la différence de distribution survient au niveau du processus d'encapsidcation. Enfin, une proportion considérable d'éléments non canoniques a étés observés in vitro et in vivo.

Titre traduit

Characterisation of the Herpes Simplex virus type 1 genome

Résumé

HSV-1 is a prevalent human pathogen that commonly leads to recurrent facialoral lesions. Although there are efficient drugs to block its replication, HSV-1 is never clear of the host Within this context, the company Cellectis aims to develop a new class of therapeutic agent (the meganucleases) that specifically cleaves into the HSV-1 genome of infected cells, thus allowing its eradication. The first question addressed during this thesis was how to assess the efficacy and safety of such a therapy. We proposed molecular combing for the direct visualization and analysis of single DNA molecules through hybridization of specific probes on uniformly and irreversibly stretched HSV-1 DNA. Following technical improvements, we successfully detected the genomes in viral particles and infected cell DNA extracts, as well as in DNA extracts from mouse, rabbit and human cornea. We were confronted to the complexity of the organization of HSV-1 genomes. Indeed, its 152 kb genome is organized in two covalently linked-segments. Each segment is composed of a unique sequence flanked by inverted repeated sequences. During replication, four HSV-1 genome isomers are produced by homologous recombination between the inverted repeats. We tested the hypothesis that the process of isomerization systematically results in a random distribution no matter which cell or strain is considered. Using HSV-1 probes, we were able to distinguish between the four isomers through molecular combing analysis. Interestingly, both in vitro and in vivo, we found imbalanced distribution functions of the strain, cell or tissue considered. In the DNA extract of infected cells, concatemeric molecules as long as 10 equivalent genomes were detected. Strikingly, among these, the isomers distribution was always equivalent. This suggests that any such imbalance may occur during encapsidation. A considerable proportion of non-canonical assortments were detected in vitro and in vivo.