Effet d’un peptide mimant le domaine N-terminal de la thrombospondine-1 sur les propriétés fonctionnelles des progéniteurs endothéliaux in vitro et in vivo : proposition d’un produit de thérapie cellulaire

Effect of a peptide mimicking the N-terminal domain of thrombospondin-1 on the functional properties of endothelial progenitor cells in vitro and in vivo : a proposal cellular therapy product

• Auteur / Autrice : Juliana Vieira Dias
• Direction : Catherine Boisson-Vidal, Verônica Maria Da Silva Morandi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie et biotechnologie
• Date : Soutenance le 09/02/2012
• Etablissement(s) : Paris 5 en cotutelle avec Universidad de Estado de Rio de Janeiro (Brésil)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie et biotechnologie (Paris ; 1997-2014)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Blanc-Brude
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Boisson-Vidal, Verônica Maria Da Silva Morandi, Olivier Blanc-Brude, Anne Pellé Meddahi, Paulo Antonio De Souza Mourao, Antonio Carlos Campos de Carvalho
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Pellé Meddahi, Paulo Antonio De Souza Mourao

Mots clés

Mots clés contrôlés

Facteur de croissance des cellules endothéliales vasculaires

Néovascularisation

Thrombospondines

Mots clés libres

Progéniteurs endothéliaux circulants

Transplantation

Thrombospondine-1

Résumé

Les progéniteurs endothéliaux circulants (EPC) sont recrutées par des sites de néovascularisation active chez l’adulte et contribuent à la réparation endothéliale et à la biologie vasculaire, dans un processus appelé vasculogenèse post-natale. Ainsi, les EPC représentent une source importante pour la thérapie de néovascularisation dans la maladie artérielle périphérique, l’ischémie du myocarde et l’accident vasculaire cérébral. Considérant que les EPC potentiellement fonctionnels sont limités dans la circulation périphérique, plusieurs molécules pro-angiogènes ont été étudiées comme agents pharmacologiques dans le but d'améliorer le recrutement des progéniteurs dans la moelle osseuse vers la circulation et la capacité d'adhérence à l'endothélium afin d’obtenir une transplantation plus efficace. La thrombospondine-1 (TSP-1) est une glycoprotéine sécrétée lors de situations ischémiques qui joue un double rôle : elle est capable d’inhiber et de stimuler l'angiogenèse. Cette double activité biologique est attribuée aux interactions de ses multiples fragments avec différents récepteurs de la surface cellulaire ainsi qu’avec des molécules solubles ou protéines ancrées à la matrice extracellulaire. L'effet pro-angiogène de la TSP-1 est assigné au domaine N-terminal qui a une forte affinité à l'héparine et aux protéoglycanes. Les recherches antérieures de notre laboratoire ont indiqué deux séquences peptidiques situées dans le domaine N-terminal de la TSP-1 (TSP-HepI, acides aminés 17-35 et TSP-HepII, acides aminés 78-94), capables d'induire la différenciation des cellules endothéliales matures (HUVEC) dans les structures vasculaires in vitro en interagissant avec le syndécanne-4, un protéoglycane héparin-sulfate membranaire impliqué dans l'adhésion focale. L’objectif de ce travail était d'étudier le potentiel de la TSP-1 comme molécule stratégique pour promouvoir une augmentation de la néovascularisation dans les tissus ischémiés, induite par des EPC en essais in vitro et in vivo. Dans un premier temps, nous avons démontré que les EPC du sang périphérique, isolées et accrues avec un milieu de culture modifié dans notre laboratoire (EGM-2/ENR), présentaient les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules formant des colonies endothéliales (ECFC) avec un haut potentiel prolifératif. Par ailleurs, ces progéniteurs endothéliaux nommées PB-ECFC ont sécrèté trois fois plus la quantité de fibronectine que les HUVEC et ont montré un réarrangement des filaments d'actine compatible avec un phénotype migratoire. Ensuite, nous avons démontré que les peptides TSP-HepI et TSP-HepII stimulaient les étapes-clés de l'angiogenèse in vitro (le chimiotactisme, l'adhésion cellulaire et la différenciation en structures capillary-like), induites par des PB-ECFC et des ECFC isolées du sang de cordon ombilical. En plus de cela, le TSP-HepI potentialise la néovascularisation in vivo induit par le FGF-2 dans les essais de matrigel plug chez la souris. Le pré-conditionnement ex vivo d’ECFC isolées du sang de cordon ombilical avec la TSP-HepI a stimulé leur migration, l'augmentation de l'expression de l'intégrine-α6 et a augmenté leur adhésion à l'endothélium activé sous condition physiologique de flux. Ce dernier effet semble être influé par le syndécanne-4, on constate que l'adhésion des ECFC est considérablement réduite en présence d’un anticorps anti-syndécan-4. La migration et la tubulogénèse ont été réduites en utilisant un peptide TSP-HepI modifié dans les sites de liaison à l’héparine (S/TSP-HepI), ou lorsque HSPG a subi une dégradation enzymatique. Ces résultats suggèrent ainsi que le domaine N-terminal de la TSP-1 pourrait être utilisé comme molécule pharmacologique pour augmenter le potentiel biologique des ECFC dans la thérapie cellulaire de néovascularisation.

As células progenitoras endotreliais (EPCs) são recrutadas para sítios de ativa neovascularização no adulto contribuindo para a biologia vascular e o reparo endotelial, processo denominado vasculogêsene pós-natal. Dessa forma, as EPCs representam uma importante fonte de terapia de neovascularização para a doença arterial periférica, a isquemia do miocárdio e o acidente vascular cerebral. Considerando que as EPCs potencialmente funcionais são limitadas na circulação, diversas moléculas pró-angiogênicas tem sido estudadas como agentes farmacológicos com o objetivo de melhorar o recrutamento das células progenitoras da medula óssea para a circulação, a capacidade de retenção no endotélio e portanto a eficiência do transplante. A trombospondina-1 (TSP-1) é uma glicoproteína secretada em situações isquêmicas que exerce um papel de destaque, sendo capaz tanto de inibir quanto de estimular a angiogênese. A dupla atividade biológica da TSP-1 é atribuída às interações de seus domínios com diferentes receptores de superfície celular assim como à proteínas solúveis ou ancoradas à matriz extracelular. O efeito pró-angiogênico da TSP-1 é atribuído ao domínio N-terminal que possui alta afinidade à heparina e a proteoglicanos. Dados obtidos em nosso laboratório apontaram duas sequências peptídicas localizadas dentro do domínio N-terminal da TSP-1 (TSP-HepI, aminoácidos 17-35 e TSP-HepII, aminoácidos 78-94), capazes de induzir a diferenciação de células endoteliais maduras (HUVECs) em estruturas vasculares in vitro, interagindo o sindecan-4, um proteoglicano de heparan sulfato membranar, envolvido na adesão focal. Nosso objetivo nesse trabalho foi investigar o potencial da TSP-1 como molécula estratégica para promover o aumento da neovascularização nos tecidos isquêmicos induzida por EPCs em ensaios in vitro e in vivo. Nós demonstramos inicialmente que as EPCs do sangue períférico isoladas e expandidas com o meio de cultura produzido no nosso laboratório, EGM-2/ENR, exibem caracaterísticas fenotípicas e funcionais de células endoteliais formadoras de colônias ou ECFCs e alto potencial proliferativo. Além disso, esses progenitores que vamos denominar PB-ECFCs, secretam 3 vezes mais fibronectina que as HUVECs e possuem um rearranjo do filamentos de actina compatível com o fenótipo migratório. Nós demonstramos em seguida que os peptídeos TSP-HepI e TSP-HepII, estimulam etapas-chave da angiogênese in vitro (quimiotaxia, adesão estática e diferenciação em estruturas tipo-capilares) induzida por PB-ECFCs e ECFCs isoladas do sangue de cordão umbilical. Além disso TSP-HepI potencializou a neovascularização in vivo, induzida pelo FGF-2 no ensaio de matrigel plug em camundongos. O pré-condicionamento ex vivo das ECFCs isoladas do sangue de cordão umbilical com TSP-HepI estimulou a migração, aumentou a expressão da integrina-α6 e aumentoua adesão ao endotélio ativado em condições fisiológicas de fluxo. Este último efeito foi mediado pelo sindecan-4, visto que a adesão foi inibida pelo anticorpo anti-sindecan-4. Além disso a migração e a tubulogênese foram efeitos reduzidos pelo uso do TSP-HepI modificado no sítio de ligação à heparina (S/TSP-HepI), ou quando o HSPG foram removidos enzimaticamente, respectivamente. Esses achados reunidos sugerem que o domínio N-terminal da TSP-1 poderia ser aplicado como uma molécula farmacológica para aumentar o potencial biológico das ECFCs na terapia celular de neovascularização.

Pas de résumé anglais