Différenciation des cellules souches embryonnaires murines et des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules dendritiques : cellules d'intérêt pour les tests de toxicologie

par Nadège Lay Russo

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire et cellulaire

Sous la direction de Christian Dani.

Soutenue en 2012

à Nice .

mots clés

• Cellules souches
• Cellules dendritiques
• Tests de toxicité
• Dermatite de contact
• Kératinocytes

Résumé

Le septième amendement à la directive cosmétique européenne impose un abandon des tests sur les animaux pour mesurer l’effet allergène ou irritant de certains composés utilisés en cosmétique. La réponse aux allergènes dans le modèle animal regroupe cinq aspects différents, mais dans les tests in vitro chaque aspect est étudié séparément. Parmi les tests de toxicité qui sont envisagés in vitre, les cellules dendritiques (cellules présentatrices de l’antigène) apparaissent come les cellules de choix pour étudier un de ces aspects. Cependant aujourd’hui il est difficile d’obtenir une source fiable et robuste de cellules dendritiques permettant de mettre au point un test réglementaire. Le but de mon projet de thèse a été de proposer un modèle alternatif à ces tests sur les animaux. Pour cela nous avons mis en place les conditions permettant de générer des cellules dendritiques à partir de cellules souches. Pour cela nous disposons de deux sources de cellules souches : les cellules souches embryonnaires murines (mES) et les cellules humaines pluripotentes induites (cellules hiPS). Les hiPS sont des cellules reprogrammées en cellules ayant toutes les caractéristiques des cellules embryonnaires sans que celles-ci ne posent de problèmes éthiques. Ces deux types de cellules souches devaient permettre de disposer d’une source inépuisable et abondante de cellules dendritiques, cellules de choix pour les tests de toxicité in vitro. Nous avons mis au point un protocole permettant de générer et purifier une population de cellules dendritiques à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Ces cellules ont été caractérisées par l’expression de marqueurs tels que CD45, CD209, CD86, MHC II, CD14, CD205, CD11c, et par l’étude de marqueurs de surface tels que CD45, CD86. Enfin, nous avons réalisé des tests fonctionnels comme des expériences d’endocytose du dextran-FITC et de réponse de cette population cellulaire à des modèles allergènes de références telles que MCI/MI ou le TNBS. Nous avons ensuite essayé de générer des cellules « dendritiques-like » à partir de cellules iPS humaines en nous basant sur l’expression de marqueurs tels que CD45, CD34, CD1a, CD1c, CD14, CD209, CD207, CD86 et HLA-DR. Plusieurs protocoles ont été envisagés. Toutefois, les cellules « dendritiques-like » obtenues représentent un faible pourcentage des cellules différenciées et le protocole est en cours d’optimisation. De plus en plus de tests utilisent les kératinocytes pour évaluer un autre aspect de la réponse aux allergènes. Nous nous sommes donc intéressés aussi à ces cellules et nous présenterons les premières étapes de différenciation des hiPS qui devraient permettre de générer les kératinocytes.

Titre traduit

Differentiation of mouse embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells into dendritic cells : interesting cells for toxicological tests

Résumé

The seventh amendment in the European cosmetic directive imposes an abandonment of the tests on animals to measure the allergenic or irritant effects of some compounds used in cosmetic. The allergenic response in animals ‘models includes five aspects but in the in vitro test each aspect is studied separately. Among the in vitro tests of toxicity which are envisaged, dendritic cells, which are antigen presenting cells, were revealed as cells of choice for study one of these aspects. However today it is difficult to obtain a reliable and strong source of dendritic cells allowing working out a reglementary test. The aim of my thesis project was to propose an alternative model in these tests on animals. For it we set up the conditions allowing generating dendritic cells derived of stern cells. For it we have two sources of stem cells (hiPS) which having all the characteristics of the embryonic stem cells without raise ethical problems. These two types of cells allowed having an inexhaustible and plentiful source of dendritic cells. We set up one protocol allowing generating and purifying a population of dendritic cells from mouse embryonic stem cells. Cells were characterized by gene expression like CD45, CD86. Furthermore we realized as functional test that consists to measure the dextran-FICT endocytosis and the answer of this cellular population to allergenic reference molecules such as MCI/MI or TNBS. We also tried to generate “dendritic-like” cells from human iPS based to expression of specifics markers as CD45, CD34, CD1a, CD14, CD209, CD207, CD86 and HLA-DR. Several protocols were envisaged. However dendritic-like cells obtained represent a low percentage of differentiated cells and the protocol is in the course of optimization. Increasingly tests use keratinocytes cells for evaluate another aspect of allergenic response. So we were interesting also to these cells and we will present first steps differentiation of hiPS that will allow generating keratinocytes.