Effet de ligands de G-quadruplexes sur la séquence terminale des télomères

par Assitan Sidibe

Thèse de doctorat en Sciences de la nature et de l'homme. Biologie moléculaire et cellulaire

Sous la direction de Jean-François Riou et de Chantal Trentesaux.

Soutenue en 2012

à Paris, Muséum national d'histoire naturelle , dans le cadre de École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris) .

Le jury était composé de José Arturo Londoño Vallejo, Raphaël Rodriguez.

Les rapporteurs étaient Sophie Bombard, Marie-Josèphe Giraud-Panis.

mots clés

• Interactions ADN-ligand
• Télomères (génétique) -- Analyse
• Séquençage des acides aminés
• Cancer -- Étiologie

Résumé

Les télomères sont des complexes nucléoprotéiques situés à lʼextrémité des chromosomes. Le rôle des télomères dans la protection du génome, et leur implication dans la sénescence et le cancer en font une cible privilégiée dans la lutte contre le cancer. Une stratégie originale consiste à bloquer lʼaccès de lʼextrémité télomérique aux protéines nécessaires à sa réplication et à sa stabilité comme par exemple la télomérase qui est activée dans 85% des cancers ou les protéines POT1 et TRF2 qui protègent lʼextrémité télomérique. A cause de la répétition en guanines du brin G, lʼextrémité des télomères peut former des structures en quadruplexes de guanines (G- quadruplexes) dont la stabilisation par des ligands spécifiques (Ligands G4) bloque la réplication des télomères et altère son intégrité. Le traitement de cellules tumorales par des ligands G4 provoque une dysfonction télomérique associée à une dissociation des protéines POT1 et TRF2 et conduit à une apoptose ou une sénescence des cellules. Lʼanalyse de la séquence terminale de lʼextrémité télomérique par la méthode STELA (Single Telomere Length Analysis) montre que la séquence terminale du brin C se termine majoritairement par la séquence ATC-5ʼ. La protéine POT1 est responsable de la résection du brin C des télomères en recrutant une exo- nucléase capable de créer le substrat simple-brin pour la télomérase. La déplétion de POT1 par ARN interférence provoque une dérégulation de la terminaison du brin C. Nous avons étudié au cours de notre travail lʼeffet de ligands G4 sur la séquence terminale du brin C télomérique au niveau des télomères du chromosome XpYp et au niveau de lʼensemble des télomères en utilisant une modification de la technique de STELA. Nos résultats montrent quʼune faible concentration des dérivés de la série des pyridines dicarboxamides provoque un effet mineur mais significatif au niveau de la séquence terminale des télomères XpYp et au niveau de lʼensemble des télo- mères dans la lignée HT1080. Au contraire, une concentration plus importante ne modifie pas la séquence terminale du brin C dans les cellules HT1080, A549 et HeLa, mais induit un stress réplicatif. Lʼeffet modeste de ces ligands sʼexplique par une activité de dissociation incomplete de la protéine POT1 des télomères comparativement à sa déplétion par ARN interférence. En effet, nous avons également montré que la déplétion quasi complète de POT1 par shARN induit une randomisation de la séquence terminale du brin C.

Résumé

The role of telomeres in protecting the genome, and their involvement in senescence and cancer make them a prime target in the fight against cancer. An original strategy is to block the access of proteins to the telomeric end necessary for replication and stability, such as telomerase which is activated in 85% of cancers or TRF2 and POT1, proteins that protect the telomeric end. Because of the guanine repetition on the G strand, telomeric ends can form quadruplex structures in guanine (G-quadruplexes) whose stabilization by specific ligands (G4 ligands) blocks the replication of telomeres and alters its integrity. Treatment of tumor cells with G4 ligands causes a dysfunction associated with the dissociation of telomeric proteins POT1 and TRF2 and leads to apoptosis or cell senescence. The analysis of the telomeric end terminal sequence by the STELA method (Single Telomere Length Analysis) shows that the C-terminal sequence of the strand ends mainly by the sequence ATC-5 ʼ. POT1 protein is responsible for the resection of the C strand of telomeres by recruiting an exonuclease capable of creating a single-stranded substrate for telomerase. Depletion of POT1 by RNA interference causes a deregulation of the C strand end. We studied in our work the effect of G4 ligands on the terminal sequence of the telomeric C strand at the telomere of chromosome XpYp and at all telomeres using a modification of the technique of STELA. Our results show that a low concentration of derivatives of the pyridine dicarboxamides series causes a minor but significant effect on the terminal sequence of XpYp telomeres and of all telomeres in HT1080 cell line. On the contrary, a higher concentration does not alter the C strand termination in HT1080, A549 and HeLa cells but induces a replicative stress. The modest effect of these ligands can be explained by an incomplete activity of dissociation of the protein POT1 of telomeres compared to its depletion by RNA interference. Indeed, we also showed that the nearly complete depletion of POT1 by shRNA randomizes the terminal sequence of the C strand.