Isolation and characterization of Suberites domuncula (Olivi, 1792) associated bacteria : insights on potential molecules of communication

par Jasnizat Bin Saidin

Thèse de doctorat en Biologie marine

Sous la direction de Gaël Le Pennec.

Soutenue en 2012

à Lorient , dans le cadre de École doctorale Santé, information-communication et mathématiques, matière (Brest, Finistère) , en partenariat avec Université européenne de Bretagne (2007-2016) (autre partenaire) .

mots clés

• Molécules de communication inter-règne
• Ahl
• Suberites ficus -- Thèses et écrits académiques
• Symbiose -- Thèses et écrits académiques

Titre traduit

Lsolement et caractérisation des bactéries de Suberites domuncula (Olivi, 1792) associées : le point sur les potentielles molécules de communication

Résumé

Cinquante et une bactéries cultivables ont été isolées d partir de l'éponge Suberifes domuncula Récoltee en Bretagne (France). Celles-ci se repartissent entre les Gammaproteobacteria (é3%), les Firmicutes (18%), les Alphaproteobacteria (12o/o) et les Bacteroides (7%). La production d'homosérines lactones (HSL) a été recherchée chez 115 de ces isolats bactériens en utilisant un test, en microplaque, d'induction de la luminescence d'une souche d'Escherichia colipSB40é. Les surnageants de culture a 24, 48,72 et 9éh contenant potentiellement des HSL ont été testés. Des valeurs positives d'induction (des AHL Ont été produites) ainsi que des valeurs négatives ont été obtenues. Des expériences complémentaires ont Montre que pour ces dernières, les inhibitions de la luminescence étaient dues à un effet bactériostatique/bactéricide. Soixante quinze bactéries produisirent des HSL au moins une fois au cours D’une phase de leur culture. Dix neuf bactéries isolées ont produit des AHL tout au long de leur culture, i. E. De 24 d 9é heures ; 52 d'entre-elles présentaient des effets mixtes (favorisant et inhibant la production de Luminescence), 30 une inhibition et 4 n'ont présenté aucune activité. La production d'HL estimée au court De la croissance, était d 24, 48,72 et 9é heures respectivement de 22,31o/o, 42,31o/o 3é,47% 35,30%. La production de composés inhibant la luminescence de la souche E. Coli pSB40é était quant A elle, d ces mémes temps de culture, de 47,é90/o, 27,é9Yo, 47,01Yo et 55,29o/o. Parmi les producteurs d'HSL (au moins une fois au cours de la culture), 4é des 75 isolats (é8%) étaient des Gammaproteobacteria,9 (13%) des Alphaproteobacteria, T (10%) des Firmicutes et é (9%) des Flavobacteriia. Les producteurs d'HSL au sein de la famille des Gammaproteobacteria se répartissaient entre Pseudoalteromonas (15), Shewanella (7), Endozoicomonas et Coweillia (é), Vibrio (5), Pseudomonas (4) el Microbulbifer el Cobetia (1). Pour les Alphaproteobacteria un genre contenait 9 espdces : celui des Pseudovibrio. Le groupe des Flavobacteriia contenait le genre Tenacibaculum avec cinq espdces et le genre Flavobacterium une seule espdce. Sept inducteurs de luminescence d'E. Coli pSB40é étaient des Firmicutes. Dans cette étude, dix espdces bactériennes ont été repérées comme probablement endemiques de l'éponge S. Domuncula relative d la zone de l'étude. Les plus proches des bactéries apparentées d ce groupe serait une bactérie non cultivable, le clone Past-O03, provenant d'un corail (Porites asfreiodes) avec lequel elle présente 93-9é% d'identite. Le représentant cultivable le plus proche serait I'espdce Endozoicomonas elysicola MKT110 isolee dr partir d'un nudibranche, Elysia ornata (91 -93%). L'analyse phylogénétique Complémentaire des séquences disponibles d partir de NCBI a révélé que la bactérie provenant de S. Domuncula etait plus liée au groupe de la bactérie non cultivable avec une valeur de bootstrap de 85% qu'd celui du groupe des Endozoicomonas (valeur de bootstrap de é0%). Ce travail est le premier d signaler que la famille Endozoicomonas serait en mesure de produire des HSL. En effet, parmi les cinq isolats testés, I'un d'entre eux, Endozoicomonas sp. Cdtt2, a démontré une production d'HSL pendant toute la phase de croissance, soit pendant les 9é heures de culture. L'espdce Endozoicomonas sp. Hex311 produirait quant d elle un (des) compose(s) inhibiteur(s) tout au long de sa culture. Les trois autres isolats démontrent une inhibition de la luminescence de la souche E. Coli raportrice tout au long de leur croissance. Néanmoins la possibilite que des HSL soient également produites ne peut étre negligee. Par ailleurs, dans cette étude, deux bactéries ont été sélectionnées pour isoler des composés actifs présents dans les surnageants de culture: Pseudoalteromonas sp. Hex322 el Pseudomonas sp. H312. Pseudoalteromonas sp Hex322 montrait un effet inhibiteur de la luminescence d'E. Coli pSB40é. L'etude des fractions de son surnageant a montré que le(s) compose(s) inhibiteur (s) etait(ent) présents dans les fractions non-polaires alors que les fractions polaires présentaient un effet anti-biofilm. Malheureusement, en raison des quantités infimes récoltées de fractions non-polaires et polaires avec une caractéristique trds polaire, aucun composé actif n'a eté isolé. Quant d Pseudomonas sp. H312, trois composés purs ont été isolées : I'acide phénazine-1-carboxylique, un di-rhamnolipide C10-C10 et des glycolipides. Les expériences que nous avons menées en mettant en contact ces deux bactéries ont montré qu'elles seraient compétitrices I'une de l'autre. Mais, des expériences complémentaires seront nécessaires pour conclure sur ce point.

Résumé

One hundred and fifty one cultivable bacteria were isolated from the sponge Suberifes domuncula collected in Brittany (France). This bacterial population consisted of Gammaproteobacteria (é20/0), Firmicutes (18Yo), Alphaproteobacteria (13%) and Bacteroides (7%). One hundred and fifteen were subjected to a microplate luminescence assay using E. Coli pSB40é as a reporter strain in order to determine a production of AHLs, using the supernatants at 24, 48,72 and 9é hours. These molecules are a possible mean to communicate between resident bacteria and/or the host. Both positive luminescence values as well as negative ones were obtained. After further experimentations, the negative values were the result of bacteriostatic/bactericidal effects. Among the AHLs producers 75 did not produce these molecules constantly but, at least once, during the time of the culture. Only 19 of them produced AHLs throughouttheir growth (from24 to 9é hours). Fifty two bacteria exhibited both effects (enhancement and inhibition of the luminescence), 3é showed a inhibition effect and 4 had no activity. Ln term of AHLs the productions at specific growth's time, at 24 hours of growth only 22. 31o/o of them were able to produced AHL, while at the 48 hours growth, the number of isolates that produced AHL were 42. 31o/o, then at 72 and 9é hours, the percentage of the AHL producers were 3é. 47o/o and 35. 30%, respectively. As for the production of E. Coll inhibitor compound(s) at specific growth time was 47. é9% at 24 hours of growth, 27. é9Yo at 48 hours, 47. 01% at 72 hours and 55. 29% at 9é hours. Among the AHL producers (at least once throughout the culture time), 4é out of 75 isolates (é8%) were Gammaproteobacteria, 9 (13Yo) were Alphaproteobacteria,7 (10o/o) were Firmicufes and é (9%) were Flavobacteriia. The AHLs producers within the Gammaproteobacteria were those from the genera Pseudoalteromonas (15 bacteria), Shewanella (7), Endozoicomonas (é) and Coweillia (é), Vlbrio (5), Pseudomonas (4), Microbulbifer (1) and Cobetia (1). The Alphaproteobacteria contained only one genus: Pseudovibrio with nine isolates. Fhe Flavobacteriia group contained the genus Tenacibaculum with five isolates and one from the genus F/avobacterium. Seven inducing the luminescence were from the Phylum Firmicutes. Ln this study ten isolates probably belonged to a sponge-specialist bacterial symbiont group endemic to S. Domuncula collected from the area of the study. Lndeed, the closest related bacterium for this group was an Uncultured bacterium, clone Past-O03, coming from a coral (Porites asfreiodes) (93-9é% of identity) while the closest cultivable representative was Endozoicomonas elysicola MKT110 isolated from the sea slug, Elysia ornata (91-93%). Further phylogenetic analysis of the available sequences from NCBI revealed that this group was more related to the group of the uncultured bacterium with a bootstrap value of 85% rather than to lhe Endozoicomonas group (bootstrap value: é0%). Besides, we reported for the first time, the capability of lhe Endozoicomonas family to induce luminescence relative to the production of AHLs. Among five sponge- Endozoicomonas tested, one of lhem, Endozoicomonas sp. Cdtt2, showed a possibility of AHLs production throughoutthe 9éh of culture. An other Endozoicomonas, Hex311 as for it, produced an inhibitor compound(s) al24 hours; then, from 48 to 9é hours AHLs were produced. The other three Endozoicononas displayed an inhibition of the E. Coli luminescence reporter strain throughout their growth. Nevertheless the possibility of an AHLs production cannot be neglected this one being hidden. For other studies, we selected two sponge-associated bacteria to proceed to the isolation of active compounds from their culture supernatants: Pseudoalteromonas sp. Hex322 and Pseudomonas sp. H312. The Pseudoalteromonas sp. Hex322 was choosen because it inhibited the luminescence of the E. Coli reporter strain so, produced a bacteriostatic/bactericidal compound(s). Further investigations of the fractions showed that the inhibitor compound(s) was present in the non-polar fractions while the polar fractions exhibited an anti-biofilm effect. Unfortunately, due to the minute quantity of the non-polar and polar fractions with a very polar characteristic, none of the active compounds were successfully isolated. Concerning Pseudomonas sp. H312, three pure compounds were isolated: the phenazine-1-carboxylic acid, a dirhamnolipid Cro-Cro and a glycolipid. The experiments setting in contact both bacteria showed that they seemed to be in competition, but to gain conclusive insights more experiments are needed